透明质酸含量测定的分光光度法

'第1卷无锡轻工大学学报Vol.14.1期,1995Nol第OUAIOFWUXIUNIVERSITYOFLIGHTINDUSTRY一种快速测定透明质酸浓度的分光光度法刘杰周心怡张华英张添(食品科学与工程系)摘要阿利新蓝染料和透明质酸形成复合物后,其吸收程度发生了差异,这种变化。、、与透明质酸浓度o一257拼g范围内有良好的线性关系本法操作简便快速重现性好,准确度和2.3.31.回收率分别为%和96%一02%;;主题词分光光度法阿利新蓝染料透明质酸中图分类号0657·3210前言,一一一透明质酸(Hyal盯oin。AcidHA)是酸性粘多糖类物质它是由N乙酞基D葡萄糖胺一一,,一,和D葡萄糖醛酸以月13键结合起来的双糖单元以月14键聚合而成的一种直链粘多,,、、。...糖普遍存在于动物和人体内如皮肤肌肉键和软骨等KMeyer和JWPalmer1934’,,,〔〕不论在HA的分布和化学结构方面年首先从牛眼玻璃体中分离出几十年来还是在生仁,,、理功能和临床应用研究均取得不断进展]骨科和烧伤外科等手术中收到了良特别在眼科好的效果。,,随着生化制药工业的发展HA具有独特的生理活性和卓越的保湿功能日益受到日用`。,化妆品行业的重视.s[〕国内外一般从脐带和雄鸡冠中提取HA作者则研究出从猪皮中提,。,取化妆品用HA的工艺成本低廉为了更好地控制生产过程和保证成品质量作者又研究出一种快速、简便、重现性好的测定HA的方法。,,,HA的定量方法常采用咔哇法等但这种方法选择性不强操作繁琐且会受样品中其.。5」-它粘多糖的干扰WGold[用阿利新蓝染料法比色测定人尿和血清中的氨基葡聚糖(Gly.saminocoglcyanGAG)本法是基于阿利新蓝染料和透明质酸中的氨基葡聚糖形成复合物后,其吸收程度发生差异,这种变化与透明质酸在一定浓度范围内呈线性关系,符合比耳定律。为此,作者据此法用于测定猪皮中的HA含量。:一一收稿日期19940305 无锡轻工大学学报第4卷第期仪器和试剂.仪器2型分光光度计上海第三分析仪器厂0型恒温水浴上海实验仪器总厂.2试剂...。0lLHN溶液称取4无水HN(R溶解于l000l水中.阿利新蓝染料(lnbl溶液上海04阿化学试剂采购供应站分装称取,.,,1msmolLCH3a。利新蓝染料溶于0l0/COON溶液中干过滤每天需新鲜配置透明质酸中科院上海生化所准确称取0.100娘HA溶于适量水,转移到100ml容,,,.,,1om。量瓶中以水定容至刻度摇匀此溶液浓度为g/ml作贮备液贮存在冰箱中工作液需每天新鲜配置。2实验方法,分别在20ml比色管中加入一定量(100拼g/ml)HA的标准工作液加12ml阿利新蓝染,,,料溶液稀释至刻度作为标准样液管;另加与HA标准液同体积的水加12ml阿利新蓝染料溶液,稀释至刻度,作为显色试剂管;再另加与HA标准工作液同体积的水,加12ml.,,3a。0smol/LCHCOON溶液稀释至刻度作为参比溶液管上述三种溶液均在25士IC条,,。件下恒温10min后在最佳吸收波长48Onm处用cZm比色皿测其吸光度3实验条件的选择3.1吸收曲线,,按试验方法在43onn:至540nm波长范围内分别测定其吸光度绘制阿利新蓝染料和一.HA阿利新蓝染料复合物的吸收曲线,见图1nU侧米彭侧奋架05040nó,-00:ID20304050607080叨]00110120浓度(nm)时间(min)图1吸收曲线图2稳定性试验(25C)一a一aHA阿利新蓝染料试剂b阿利新蓝染料试剂HA阿利新蓝染料复合物b阿利新蓝染料试剂 刘杰等一种快速测定透明质酸浓度的分光光度法,,一由图1可看出阿利新蓝染料试剂在480nm处表现为吸收最小而HA阿利新蓝染料,,复合物却在49onm处吸收最小在480九m处两者对比度较大故选择480nm作为最佳吸收波长。3.2稳定性试验,,.按试验方法在48Onm处测定其放置一定时间后吸光度的变化见图2,,一由图2所示在25士IC放置10min后至h2内HA阿利新蓝染料复合物和阿利新蓝染料本身吸光度变化很小,故选择恒温25’C放置10min后进行测定。3.3温度的影响一HA阿利新蓝染料复合物的存在与温度关系较大标样按试验方法测定温度对吸光度的,影响见图.3,,一,从图3可见随温度上升HA阿利新蓝染料复合物吸光度发生变化因此必须选择25`,,。士1C条件下恒温10min后才能测定所以在不同批次实验时工作曲线需进行斜率校正3.4工作曲线的绘制.,,,准确称取标样010729用水溶解后稀释至10ml容量瓶内定容得贮备液。3ml,,。吸取贮备液再在10ml容量瓶中稀释定容得工作液取一定量工作液按试验方法测得吸光度,绘制工作曲线,线性关系良好,见图4.回归:线方程..夕一3一,HA=145又10+184只10Cy=0.9997八UǎU侧嗽督4030留娜积。匕飞一一一百一一一万一一一万一4080120160200240280。HA浓度(户9zL温度(C))图3温度的影响图4HA的工作曲线3.5干扰试验酶解液或成品中由于分离不完全,可能会含有水不溶性蛋白质,产生浑浊,影响吸光度,。数值所以必须进行干扰试验10.,,,。精确称取9明胶用水温热溶解后稀释至15oml干过滤取滤液备用分别吸取上述明胶溶液O,0.20,0.40,0.50,0.60,0.70l放入试验方法所m述之参比液,,,,:,管内测得吸光度A另将上述同体积的明胶溶液则放入标准样液管中测得吸光度A然后求出它们之间的差值△A一AZ一A,,见表1. 龙锡轻工大学学报第4卷第期表蛋白质干扰试验n:l.020.400.00·600·0加入明胶溶液体积(00.....l参比液管吸光度(00020040000068000标准吸光度200.000.020.220.0.4(八.....吸光度差值△一八:一魂(00600620060060064由Z,,浓度变大,浑浊,可看出随着明胶加入量增多度随之也增大造成吸光度数值上,A一A:一,,,升但从吸光度差值△A表明在扣除了明胶浊度造成的影响后吸光度差值基..本上保持稳定,数值在0065士。003左右,从而也可说明蛋白质不会与阿利新蓝染料发生,也不影响A一,,作用H阿利新蓝染料复合物的形成因此用差减法可以扣除未除净的蛋白质造成的浑浊对吸光度影响。3.6重复性试验吸取样品酶解液sml,在10m,。,lmll容量瓶中稀释定容摇匀然后再吸取稀释液按试验方法进行吸光度测定。数据见表.2表2重复性试验,,测定次数()12345678平均值5CV(%).,....,...吸光度A019402000195029201920.20001980200019636xlo一“184样品测定,本法既可以作为猪皮提取HA酶解条件时的质量控制又可作为猪皮HA成品的含量测定。4.1酶解条件时的质量控制4.1.1酶解液A的测定,,H称取一定量猪皮样在特定的工艺条件下进行酶解得酶解液50Oml左右。精确吸取Zml酶解液,稀释至IOm!定容,得样品稀释液,再按试验方法进行HA的测定,注意斜率校正因子,见表3.表3酶解液HA的测定测定次数样品液空白液斜率校正酶解液HA平均值CV7于AA。胖gn、拜gn,()吸光度吸光度因子人浓度(/l)(/l)(%)0.1685221745401780.0040.84855553512.72.0.1705300.170530,,,.4L2回收率试验吸取酶解液Zml稀至10ml定容根据试验方法进行回收率试验结果见表.4表4酶解液HA的回收率试验测定次数样品液加标量测得HA量CV争汉()HA(拜g)HA(拜g)(%)28241198.028241196.3 刘杰等:一种快速测定透明质酸浓度的分光光度法4续表4测定次数样品液加标量测得H量V(一:H(拌H(“(拜(.00204.2成品中H含t测定H液经浓缩和真空干燥、猪皮灭菌后表5成品中HA的含t测定得无臭、无味灰白色无定形粉末,按试验方法测定次数HA含量HA含量平均值CV,2进行不同批次产品分析,结果见表5.()(%)(%)(写)141.942.0...5结论。42.。41。。37。944.15采用阿利新蓝染料分光光度法测定透明,,54L7质酸含量操作简便每份样品在hl以内就,,、可以完成测定干扰因素少数据的重复性一一J一一一止三二一一一一一一一一一一,..,4,32%精密度也高变异系数为2%回收率96写一10可以认为是一种准确测定HA的好方法。致谢承无锡化工研究设计院顾秀芬高级工程师提出了宝贵的意见,并核实了样品测试,在此谨表谢意。参考文献MeyerKetal.J.Biol.Chem.1934,107:929.,,:沈勃江等生化药物杂志1985223.,,:凌沛学等生化药物杂志198641.,,:杨根源日用化学工业1986525...,GoldWAnalBioehem197999:183 48七踢轻1一大学学报第14卷第1期ASimPIeSPeetroPhotometrieMethodforHyaluronicAeidAssayLiuJieZhouXinyiZhangH一,ayingZhangTianp.ooo.ann.(eDtfFdcSidEg)straetneroeeureorlyauroneaeassa5ntrouee,e5aseonreAbAwPdfIliidy1iddwhih1bdh一absorPtionsPeetradiffereneebetweenaleianbluedyeandsolublealeianblueGAGofthe.HAeomplexesAlinearrelationshipbetweeneoneentraionquantitiesintherangeofo一.-257拌9wasobservedThespeetroPhotometriemethod15deseribedinthisrePortwhiehalo.lwsrhesimplerapidandreprodueibleThepreeisionandreeoveryofthismethodarewin.an.reseetvey.thi23%d963%一102写Pil一SubjeetwordsSPeetroPhotometry;Aleianbluedyes;Hyaluronieaeid(HA)'