紫外-可见分光光度法.ppt

'第十三章紫外-可见分光光度法1 第十三章紫外-可见分光光度法UV/VisSpectroscopy13.4提高测量灵敏度和准确度的方法13.2分光光度法基本原理13.1物质的吸收光谱13.3紫外－可见分光光度法2 分析方法的分类按方法的原理：可分为化学分析和仪器分析。化学分析：凡主要利用化学原理进行分析的方法称为化学分析法；仪器分析：主要利用物理学原理进行分析的方法则称为仪器分析法。如：光谱分析法，色谱分析法，质谱分析（MS）法，电化学分析法，核磁共振（NMR）分析法等。光谱分析法：常用的有可见－紫外分光光度法（UV/Vis）、红外分光光度法（IR）、荧光光度法、原子吸收法和X射线原子荧光法等。3 UV/Vis主要用于药物制剂的含量测定。激光诱导荧光光谱的灵敏度已达10-22克，达到了检测单个分子的水平，可用于癌症的早期诊断。分光光度法（吸光光度法）：根据物质的吸收光谱和光的吸收定律，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。或者说它是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。4 分光光度法的特点：灵敏度高------10-5mol·L-1~10-6mol·L-1相对误差小------2%~5%应用广泛-----医药、卫生、环保、化工等领域。根据测定时所选用的光源紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光度法5 常量分析、半微量和微量分析6 13.1物质的吸收光谱7 13.1物质的吸收光谱波长范围辐射类型光谱类型0.1~10nm10~200nm200~400nm400~760nm0.76~2.5μm2.5~50μm50~1000μm0.001~1m1~1000mX射线远紫外近紫外可见光近红外红外远红外微波无线电波X光电子能谱真空紫外光谱紫外-可见（吸收、发射）光谱及荧光光谱红外光谱微波波谱核磁共振光谱8 13.1物质的吸收光谱9 13.1物质的吸收光谱物质对光的选择性吸收光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量大小与波长和频率有关。辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射或吸收，每一份称一个光子。光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：E=hυ=hcυ=c光的波长光速光的频率=10 13.1物质的吸收光谱能量E基态E0第一激发态E1第二激发态E2第三激发态E3吸收光谱发射光谱E=hυ当一束光照射到某物质或某溶液时，该物质的分子、原子或离子与光子作用，光子的能量发生转移，物质中的这些粒子就会发生能级跃迁，从较低能量状态（基态）跃迁到较高能量状态（激发态）：这一过程称为物质对光的吸收。11 13.1物质的吸收光谱White:f(l)=constantMonochromaticlight:Red:650nmGreen:520nmBlue:450nm12 13.1物质的吸收光谱13 13.1物质的吸收光谱ReflectanceSpectrumSpectralPowerDistributionSpectralPowerDistributionIlluminantD65ElectromagneticWave(nm)14 13.1物质的吸收光谱15 13.1物质的吸收光谱UV/VisradiationandElectronicExcitationsThedifferenceinenergybetweenmolecularbonding,non-bondingandanti-bondingorbitalsrangesfrom125-650kJ/mole,correspondstoEMradiationintheultraviolet(UV)region,100-350nm,andvisible(Vis)regions350-700nmofthespectrum.UsingIRweobservedvibrationaltransitionswithenergiesof8-40kJ/molatwavelengthsof2500-15,000nm物质的吸收光谱16 13.1物质的吸收光谱Energys*psp*nsspnns*p*p*s*p*alkanes150nmcarbonyls170nmunsaturatedcmpds.180nmO,N,S,halogens190nmcarbonyls300nmconjugatedUnlikeIRorNMR,wheretheremaybeupwardsof5ormoreresolvablepeaksfromwhichtoelucidatestructuralinformation,UV/vistendstogivewide,overlappingbands.17 13.1物质的吸收光谱absorptionspectrumExcitationofσ-electronsneedshighenergyradiationExcitationofn-and-electronsispossiblebyUVandvisiblelightHowever,n→∗transitionsareoftennotallowedOnly−-transitionsareusefultoobtainhightinctorialstrength!18 13.1物质的吸收光谱19 13.1物质的吸收光谱将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，测定这一溶液吸光度A。每种波长的单色光都有其相对应的吸光度。然后以A为纵坐标，波长为吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为最大吸收波长，maxmax=515A480520560nm横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱。20 13.1物质的吸收光谱吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸收程度是不同的。三（邻二氮菲）合铁配合物的吸收光谱。表明一种物质的不同浓度的溶液，吸收光谱的形状基本相同，最大吸收波长也一样吸收光谱体现了物质的特性：吸收曲线的形状和max是定性分析的基础溶液的浓度愈大吸光度愈大是定量分析的基础21 13.1物质的吸收光谱Organicdyes22 13.1物质的吸收光谱23 13.2分光光度法基本原理透光率和吸光度I0=Ia+It+Ir透射光的强度It与入射光的强度I0的比值称为透光率I0It实验中，被测溶液和参比溶液分别置于同样质地和厚度的比色皿中，反射光强度大小近似可相互抵消(以参比溶液校正)，则上式简化为I0=Ia+It透光率愈大，溶液对光的吸收愈少IrIa0tITI=24 13.2分光光度法基本原理透光率的负对数称为吸光度A(absorbance)吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多25 13.2分光光度法基本原理Lambert-Beer定律溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射光波长、溶液浓度、液层厚度及温度等因素有关。1760年，Lambert从实验中找到了A与液层厚度的关系式：A=k1bk1为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度和温度有关的常数当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、浓度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与液层厚度成正比26 13.2分光光度法基本原理1852年，Beer从实验中找到了A与溶液浓度的关系式：A=k2ck2为与被测物性质、入射光波长、溶剂、液层厚度和温度有关的常数当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、液层厚度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与溶液浓度成正比27 13.2分光光度法基本原理合并这两个式子，得到单位b液层厚度：cmc物质的量浓度：mol·L-1摩尔吸光系数：L·mol-1·cm-1Lambert-BeerLow吸光度=吸光系数介质厚度浓度A=ab若浓度的单位改为质量浓度，则单位b液层厚度：cm质量浓度：g·L-1a质量吸光系数：L·g-1·cm-1A=bc=aMT=10-bc28 13.2分光光度法基本原理解：（1）A=ab0.22=a214010-6a=785.7(L·g-1·cm-1)（2）=aM=785.7112.4=8.83104（L·mol-1·cm-1）（3）A=-lgT=0.22lgT=-0.22，T=10-0.22=0.60=60%例Cd2+浓度为140µg·L-1，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度2cm，吸光度为0.22，求a、和T29 13.3紫外－可见分光光度法分光光度计30 13.3紫外－可见分光光度法SingleBeamSpectrometerUV/VisSpectroscopy分光光度计四大系统31 13.3紫外－可见分光光度法samplereferencedetectorI0I0I0Ilog(I0/I)=A200700l,nmmonochromator/beamsplitteropticsUV-VISsources(CCDs)32 13.3紫外－可见分光光度法Deuteriumlamp–coverstheUV–200-330nmTungstenlamp–covers330-700nmblackbodyradiationspectrum33 13.3紫外－可见分光光度法Photomultipliertubes(PMTs)Charge-coupleddevices(CCDs)34 13.3紫外－可见分光光度法测定方法maxc（mg/L）A40801201602000.60.40.20.0Lambert-BeerLawA=bcA=kc工作曲线样品35 13.3紫外－可见分光光度法A<1.0；R>0.999max＝380nmmax＝380nm36 13.4提高测量灵敏度和准确度的方法分光光度法的误差偏离朗伯-比尔定律仪器测量误差待测组分浓度过高、化学反应的影响、谱带宽度过大、pH值的影响、杂质的影响、光散射的影响光电池灵敏性差、光源不稳定、读数不准等37 选择显色反应的一般标准:(1)选择性要好。(2)灵敏度要高。(3)对比度要大。如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上。(4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳定。(5)显色反应的条件要易于控制。显色条件的选择13.4提高测量灵敏度和准确度的方法38 （1）颜色鲜明，测定的灵敏度很高；（2）稳定，能抗辐射；（3）专用性强。（4）可被萃取到有机溶剂中，发展了萃取光度法。（5）在显色分子中，金属所占的比率很低，提高了测定的灵敏度。应用最广泛的有邻二氮菲、双硫腙、二甲酚橙、偶氮胂III、铬天青S金属螯合物的优点13.4提高测量灵敏度和准确度的方法39 共存离子的干扰及消除共存离子的干扰与试剂生成有色配合物干扰离子本身有颜色与试剂结合成无色配合物与被测离子结合成离解度小的另一化合物13.4提高测量灵敏度和准确度的方法40 消除干扰的方法（1）控制酸度（2）加入掩蔽剂（3）采用萃取光度法（4）在不同波长下同时测定（5）寻找新的显色反应（6）分离干扰离子13.4提高测量灵敏度和准确度的方法41 测定实例：铁含量的计算1．标准曲线的绘制吸取250mg/L铁标准溶液0.00、2.0、4.0、8.0、16.00ml，分别注入50ml容量瓶中，加盐酸羟胺，加邻二氮菲，定容，测定吸光度，绘制标准曲线。2．样品的测定试样经处理，配成在具有线性关系范围内的质量浓度，取1.00ml试样溶液，加盐酸羟胺，加邻二氮菲，定容，测定吸光度。3．铁含量的计算从测定的吸光度值，在标准曲线上找出样品的质量浓度，根据样品溶液稀释的倍数，求出样品中铁的含量。example这就是空白溶液！13.4提高测量灵敏度和准确度的方法42 14.2荧光分析法Fluorescentminerals43 14.2荧光分析法基本原理44 14.2荧光分析法45 14.2荧光分析法Mirror-image,StokesShift,Kasha’srule(differentexsameem)46 14.2荧光分析法光谱法分为原子光谱法和分子光谱法。原子光谱是由原子外层或内层电子能级的变化产生的，表现形式为线光谱。分子光谱（包括分子吸收光谱和荧光光谱等）是由分子中电子能级，振动能级和转动能级的变化产生，表现形式为带光谱。high-pressurexenon(Xe)arclamp47 14.2荧光分析法Emissiondecaylifetimerelaxation(10-12s)S0S1S1hvAhvFknrSimplifiedJablonskidiagram:EmissionrateKnr:nonradiativedecayrateLifetimeIntrinsicornaturallifetimeThelifetimeofthefluorophoreintheabsenceofnonradiativeprocessesiscalledtheintrinsiclifetime.48 14.2荧光分析法Emissiondecaylifetime49 14.2荧光分析法EmissionquantumyieldRelationshipwithlifetimeTheratioofthenumberofphotonsemittedtothenumberabsorbed50 14.2荧光分析法EmissionquantumyieldInsolutioncomparedwithastandards=r∙(Br/Bs)∙(ns/nr)2∙(Ds/Dr)B=1–10–ALThesubscriptssandrrefertothesampleandreferencestandardsolutionrespectively;nistherefractiveindexofthesolvents;Distheintegratedintensityofemission;andistheluminescencequantumyield;A(<0.2)istheabsorbanceattheexcitationwavelengthandListheopticalpathlength(L=1cminallcases).Demas,J.N.;Crosby,G.A.J.Phys.Chem.1971,75,991.51 14.2荧光分析法EffectsofmolecularstructureonfluorescenceExtentof-conjugatedsystem.Natureofthelowest-lyingtransition52 14.2荧光分析法EffectsofmolecularstructureonfluorescenceEnhancetherigidityofplanarsquareF=0.18Fluorene,F»1.0Fluorescein,F=0.97Phenolphthalein,F»0.053 14.2荧光分析法EffectsofmolecularstructureonfluorescenceEnhancetherigidityofplanarsquare54 14.2荧光分析法EffectsofmolecularstructureonfluorescenceSubstituenteffect化合物相对荧光强度C6H610C6H5COOHC6H5NO230C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020C6H5ClC6H5BrC6H5I750Electron-donatingsubstituentsElectron-withdrawingsubstituentsInternalheavyatomeffect55 14.2荧光分析法EffectsofmolecularstructureonfluorescenceSubstituenteffectJ.Org.Chem.2004,69,1723-1725Chem.Eur.J.2006,12,4523–453556 14.2荧光分析法TemperatureEffects57 14.2荧光分析法TemperatureEffectsDaltonTrans.,2010,39,1558–156758 14.2荧光分析法ConcentrationEffects59 14.2荧光分析法SolventEffects4-dimethylamino-4"-nitrostilbene(DNS)PhotographandemissionspectraofDNSinsolventsofincreasingpolarity.H-hexane;CH-cyclohexane;T-toluene;EA-ethylacetate;Bu-n-butanol.Em>>Abs60 14.2荧光分析法SolventEffectsTheeffectsofchemicalenvironmentonfluorescenceprobes,1971,AcademicPress,NewYork61 14.2荧光分析法pHEffects62 14.2荧光分析法spinquantumnumberS=si,withsi=+1/2or-1/2Triplet-phosphorescence(磷光)63 14.2荧光分析法Spin-OrbitCoupling–Heavy-AtomEffect64 14.2荧光分析法Spin-OrbitCoupling–Heavy-AtomEffect(1)intraligandtransition(IL),(2)ligand-to-metalchargetransfer,(3)ligandfieldtransition(LFord-d),(4)metal-to-ligandchargetransition(MLCT),(5)interconfigurationalmetal-centred,d-s(MC),(6)interconfigurationalmetal-centred,d-p(MC).S0-forbiddenInCBPfilm,F»1.0atRT.65 14.2荧光分析法荧光定量分析方法F=K´´F(I0—I)=εbcifεbc＜0.02,F=K´I02.303εbcIfI0constant,F=K·c(K=K´I02.303εb)K´=K´´F66 14.2荧光分析法荧光分光光度计67 14.2荧光分析法68 14.2荧光分析法UV/ViscellFluorescentcell69 14.2荧光分析法FluorescenceAdvantage1.ManymoleculesabsorbintheUV-Visibleregionofthespectrum2.Itissimpletodecoupletheexcitationandemissionspectraexcitation≠emission3.Mixturescanbeanalyzedbytuningexcitationoremission4.Nondestructivetechnique(unlesssampleisphotosensitive)5.Highprecisionandwidescope,lowlimitofdetection(10-11to10-12mol/L),downtosinglemoleculedetection6.Generally,inexpensiveinstrumentation70 14.2荧光分析法IonSensor71 14.2荧光分析法IonSensor72 14.2荧光分析法胺类、甾族化合物、蛋白质、酶与辅酶、维生素及多种药类通过某些化学反应转化成荧光物质后均可用荧光分析法测定。73 14.2荧光分析法“forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFP”TheNobelPrizeinChemistry2008OsamuShimomurabioSensor74 14.2荧光分析法TheNobelPrizeinChemistry200875 14.2荧光分析法TheNobelPrizeinChemistry2008bioSensor76 14.2荧光分析法TheNobelPrizeinChemistry2008bioSensor77 14.2荧光分析法TheNobelPrizeinChemistry2008TheFirstHumanGFPTransgenic?78 14.2荧光分析法bioSensorJ.AM.CHEM.SOC.2010,132,4455–446579 教学基本要求1.掌握分光光度法基本原理—Lambert-Beer定律，能熟练运用Lambert-Beer公式进行有关计算。2.掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸光系数的概念。3.熟悉标准曲线法及标准对照法。4.了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。5.了解分光光度计的基本构造；提高测量灵敏度和准确度的方法。80 参考练习题习题11、1381'