第七章 紫外可见分光光度法.ppt

'第七章紫外可见分光光度法分子光谱(UV-VISspectrometry)1 一、概述–分子光谱原子核在其平衡位置附近的相对振动---振动能级（Ev）物质分子内部三种运动形式电子相对于原子核的运动---电子能级（Ee）分子本身绕其重心的转动---转动能级（Er）2 一、概述–分子光谱Ｅ＝Ｅe+Ｅv+ＥrΔΕe>ΔΕv>ΔΕr电子能级振动能级转动能级3 一、概述–分子光谱ΔΕr0.005～0.050eV远红外光谱(分子转动光谱)ΔΕv0.05～１eV红外光谱(分子振动光谱)ΔΕe1～20eV紫外—可见光谱(分子的电子光谱)4 二、紫外可见光谱可见吸收光谱：电子跃迁光谱吸收光波长范围400780nm，主要用于有色物质的定量分析紫外吸收光谱：电子跃迁光谱吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。特点灵敏度高???选择性较好??通用性强准确度较好操作简单价格低廉5 吸收曲线与最大吸收波长max用不同波长的单色光照射，测吸光度二、紫外可见吸收光谱不同浓度的溶液，测吸光度6 二、紫外可见吸收光谱同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性分析的依据。吸收谱带的强度与该物质分子吸收的光子数成正比，是物质定量分析的依据。7 有机化合物的紫外—可见吸收光谱分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：形成单键的σ电子、形成双键的π电子、未成键的n电子分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁，所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊<π→π＊200nm）含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁C=C;C=C;N=N;C=O有机化合物的紫外-可见吸收光谱分析多以这两类跃迁为基础*比n*跃迁几率大100-1000倍*跃迁吸收强，=104n*跃迁吸收弱，50011 紫外光谱中常用的术语生色团：从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。12 紫外光谱中常用的术语助色团助色团是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。13 生色团——含有键不饱和官能团助色团——基团本身无色，但能增强生色团颜色为含有n电子，且能与电子作用，产生n共轭184204254270苯（*）苯酚（—OH为助色团）/nm紫外光谱中常用的术语14 紫外光谱中常用的术语红移与蓝移有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-SR、-NR2）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应。在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移效应。如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3。15 红移—λmax向长波方向移动蓝移—向短波方向移动增色效应—吸收强度即摩尔吸光系数，ε增大的现象减色效应—吸收强度即摩尔吸光系数,ε减小的现象引入取代基或改变溶剂紫外光谱中常用的术语16 无机化合物的紫外—可见吸收光谱⑴过渡金属离子d一d的电子跃迁（2）镧系和锕系离子的f一f电子跃迁⑶电荷转移吸收光谱-络合物的吸收在分光光度法中具有重要意义:微量组分的定量分析。当吸收紫外可见辐射后，分子中原定域在金属M轨道上电荷的转移到配位体L的轨道，或按相反方向转移，这种跃迁称为电荷转移跃迁，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。17 有机化合物紫外-可见吸收光谱1.饱和烃及其取代衍生物饱和烃类分子中只含有键，只能产生*跃迁。饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，超出紫外、可见分光光度计的测量范围。饱和烃的取代衍生物如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生n*的跃迁。n*的能量低于*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n*跃迁分别出现在173、204和258nm处。氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，显示了助色团的助色作用。直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外和可见吸收光谱的良好溶剂。18 2.不饱和烃及共轭烯烃在不饱和烃类分子中，除含有键外，还含有键，它们可以产生*和*两种跃迁。*跃迁的能量小于*跃迁。例如，在乙烯分子中，*跃迁最大吸收波长为180nm在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。在共轭体系中，*跃迁产生的吸收带又称为K带。有机化合物紫外-可见吸收光谱19 3.羰基化合物羰基化合物含有C=O基团。C=O基团主要可产生*、n*、n*三个吸收带，n*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等。羧酸及羧酸的衍生物虽然也有n*吸收带，但是，羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于助色团上的n电子与羰基双键的电子产生n共轭，导致*轨道的能级有所提高，使n*跃迁所需的能量变大，n*吸收带蓝移至210nm左右。有机化合物紫外-可见吸收光谱20 4.苯及其衍生物苯有三个吸收带，它们都是由*跃迁引起的。E1带出现在180nm（MAX=60，000）；E2带出现在204nm（MAX=8000）；B带出现在255nm（MAX=200）。在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加而引起的。在极性溶剂中，这些精细结构消失,当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。有机化合物紫外-可见吸收光谱21 5.稠环芳烃及杂环化合物稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带，但这三个吸收带均发生红移，且强度增加。随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强度也相应增加。当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。此外由于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产生n*吸收带。有机化合物紫外-可见吸收光谱22 溶剂对紫外吸收光谱的影响1.溶剂的极性溶剂的极性越强，由π→π＊跃迁产生的谱带向长波方向移动越显著。这是因为发生π→π＊跃迁的分子激发态的极性总大于基态，在极性溶剂的作用下，激发态能量降低的程度大于基态，从而使基态到激发态跃迁所需的能量变小，使吸收带发生红移。所用溶剂极性越强，则由n→π＊跃迁产生的谱带向短波方向移动越明显，即蓝移越大。发生n→π＊跃迁的分子都含有未成键的孤对电子，与极性溶剂形成氢键，使得分子的非键轨道能量有较大程度的降低，使n→π＊跃迁所需的能量相应增大，致使吸收谱带发生蓝移。23 2.pH值对紫外光谱的影响pH值的改变可能引起共轭体系的延长或缩短，从而引起吸收峰位置的改变，对一些不饱和酸、烯醇、酚及苯胺类化合物的紫外光谱影响很大，如果化合物溶液变为碱性时，吸收峰发生红移，表明该化合物为酸性物质。如果变为碱性，发生蓝移，可能为芳胺。例如：苯酚（当pH大于7时，发生红移）苯胺与盐酸苯胺溶剂对紫外吸收光谱的影响24 三、光的吸收定律朗伯—比耳定律布格(Bouguer)—1729年朗伯(Lambert)—1760年光的吸收程度和吸收层厚度的关系A∝b25 三、光的吸收定律比耳(Beer)—1852年朗伯—比耳定律光的吸收程度和吸收物浓度之间的关系A∝c26 三、光的吸收定律光的吸收程度和吸收层厚度的关系A∝b光的吸收程度和吸收物浓度之间的关系A∝c朗伯—比耳定律A=εbc吸光光度法的理论基础和定量测定的依据朗伯(Lambert)比耳(Beer)27 A：吸光度---溶液对光的吸收程度b：液层厚度(光程长度,cm)c：溶液的摩尔浓度，mol·L－１ε：摩尔吸光系数，L·mol－１·cm－１；三、光的吸收定律A＝lg（I0/It)=εbc浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度A＝lg（I0/It)=abcc：溶液的浓度，g·L－１a：吸光系数，L·g－１·cm－１浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度a——εa=ε/M（M为摩尔质量）28 摩尔吸光系数三、光的吸收定律不随浓度c和光程长度b的改变而改变，在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。代表可能达到的最大灵敏度。εmax越大表明光度法测定该物质灵敏度越高ε>105：超高灵敏；ε=(6～10）×104：高灵敏ε<2×104：不灵敏。29 三、光的吸收定律透过率T—入射光透过溶液的程度T=It/I0吸光度A与透过率T的关系:A＝－lgT30 偏离朗伯—比耳定律的原因当溶液浓度较高时，标准曲线常发生弯曲，称为偏离朗伯—比耳定律。原因物理性因素化学性因素31 物理性因素难以获得真正的纯单色光——仪器的原因选择比较好的单色器将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处解决办法前提条件之一：入射光为单色光32 化学性因素假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用当溶液浓度c>10－2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度33 例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrＯ42-＋2H＋=Cr2Ｏ72-＋H2Ｏ溶液中CrＯ42-、Cr2Ｏ72-的颜色不同，吸光性质也不相同,故溶液pH对测定有重要影响.34 四、紫外可见分光光度计35 四、紫外可见分光光度计36 HitachiU3010紫外可见分光光度计普析通用TU-1221型紫外可见分光光度计四、紫外可见分光光度计37 波长330~800nm722型光栅分光光度计四、紫外可见分光光度计38 光度计的基本结构光源单色器狭缝样品室检测器39 显示屏波长调节旋钮比色池架四、紫外可见分光光度计40 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱具有足够的辐射强度较好的稳定性较长的使用寿命可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm紫外区：氢、氘灯，发射185～400nm的连续光谱光源41 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。单色器棱镜、光栅42 狭缝狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽。43 样品室在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。44 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号检测器光电池、光电管或光电倍增管。结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理45 单光束仪器HW红蓝S1S2单色器样品室46 单光束仪器的缺点：操作麻烦：空白——IO样品——I任一波长不能进行吸收光谱的自动扫描光源不稳定性影响测量精密度47 双光束仪器IOI48 双光束仪器的特点和不足：测量方便，不需要更换吸收池补偿了仪器不稳定性的影响实现了快速自动吸收光谱扫描不能消除试液的背景成分吸收干扰49 双波长仪器切光器12采用双单色器50 /nmA0200300400待测成分干扰成分12选择等吸收的两个波长51 消除光谱重叠干扰A1=Aa1+Ai1A2=Aa2+Ai2Ai1=Ai2A=A1-A2(从图中可知)=Aa2-Aa1=（a1-a2）bCa消除了共存组分的干扰52 双波长仪器能否消除背景干扰？A1=lgI0/I1=1bC+AbA2=lgI0/I2=2bC+Ab式中Ab为背景吸收或干扰物质的吸收若波长选择合适，1和2处Ab相同53 则A=lgI1/I2=（1-2）bC因此测量两波长吸光度之差，就消除了背景吸收的干扰。54 /nmA0200300400123多组分混合物中各组分分别测定——多波长分光光度法55 A1=11C1+12C2+13C3A2=21C1+22C2+23C3A3=31C1+32C2+33C3ij为在波长i测定组分j的摩尔吸光系数Ai为在波长i测得该体系的总吸光度解上联立方程可求出待测物浓度C1、C2、C356 显色反应及显色条件的选择显色反应将待测组分转变成有色化合物的反应显色剂与待测组分形成有色化合物的试剂五、无机分析应用显色反应类型络合反应氧化还原反应取代反应缩合反应选择要素灵敏度高(大)选择性好(以金纳米为例)有色生成物稳定组成恒定(不同络合比颜色不同)显色剂在测定波长处无明显吸收有色化合物与显色剂颜色对比度大，要求△>60nm。57 金纳米58 AminoacidAggregation金纳米对氨基酸没有选择性59 尿样的测定12nm40nm60 显色条件的选择1.显色剂用量P1602.反应体系的酸度影响金属离子和显色剂的存在形式、络合物组成、稳定性及反应进行程度61 显色条件的选择3.显色时间4.显色温度5.溶剂6.干扰的消除选择适当的显色反应条件加入掩蔽剂分离干扰离子(萃取法、离子交换法、吸附法等）62 吸光度测量条件的选择1.选择适当的入射光波长一般应该选择λmax为入射光波长。但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长（P163图7-17）。2.控制适宜的吸光度（读数范围）Tmin＝36.8%,Amin＝0.434（吸光度测量误差最小）最佳读数范围T%=70％～10％A=0.15～1.063 3.选择合适的参比溶液若仅待测组分与显色剂反应产物有吸收，其它试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；若显色剂或其它试剂略有吸收，试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；若待测试液有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液。64 定性分析结构分析标准谱图对照经验规则计算官能团鉴定顺反异构体的确定互变异构体的确定P147~149五、有机分析应用65 化合物的定性分析利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系,如C=C－C=C、C=C－C=O、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。鉴定化合物主要是根据光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λmax即摩尔吸光系数ε值，来进行鉴定。66 鉴定的方法有两种：（1）与标准物、标准谱图对照：将样品和标准物以同一溶剂配制相同浓度溶液，并在同一条件下测定，比较光谱是否一致。（2）吸收波长和摩尔吸光吸收：如果样品和标准物的吸收波长相同，摩尔吸光吸收也相同，可以认为样品和标准物是同一物质。化合物的定性分析67 ⑴若在200～750nm波长范围内无吸收峰，则可能是直链烷烃、环烷烃、饱和脂肪族化合物或仅含一个双键的烯烃等。不含共轭体系，无醛、酮、溴、碘。官能团鉴定⑵若在270～350nm波长范围内有低强度吸收峰(ε＝10～100L·mol-1·cm-1),（n→π跃迁），则可能含有一个简单非共轭且含有n电子的生色团，如羰基。⑶若在2５0～300nm波长范围内有中等强度的吸收峰则可能含苯环。化合物的结构分析68 ⑷若在210～250nm波长范围内有强吸收峰，则可能含有2个共轭双键；若在260～300nm波长范围内有强吸收峰，则说明该有机物含有3个或3个以上共轭双键。⑸若该有机物的吸收峰延伸至可见光区，则该有机物可能是长链共轭或稠环化合物。化合物的结构分析69 五、应用-有机分析异构体的确定反式异构体的λmax和εmax大于顺式异构体化合物纯度的检验氢键强度的测定成分分析70 异构体的确定对于构造异构体，可以通过经验规则计算出λmax值与实测值比较，即可证实化合物是哪种异构体。对于顺反异构体，一般来说，某一化合物的反式异构体的λmax和εmax大于顺式异构体。另外还有互变异构体，常见的互变异构体有酮－烯醇式互变异构，如乙酰乙酸乙酯的酮－烯醇式互变异构。71 成分分析紫外光谱在有机化合物的成分分析方面的应用比其在化合物定性鉴定方面具有更大的优越性，方法的灵敏度高，准确性和重现性都很好，应用非常广泛。只要对近紫外有吸收或可能有吸收的化合物，均可用紫外分光光度法进行测定，定量基础朗伯-比尔定律。72 测定蛋白浓度蛋白浓度可用紫外吸收法进行测定，基于蛋白质中的Tyr,Trp以及Phe在280nm有最大特征吸收所建立的方法，同时核酸在260nm有特征吸收，需要校正以除干扰。73 本章重点1.紫外-可见吸收光谱法的特点、基本原理。2.Lambert-Beer定律物理意义、成立条件及影响因素。3.吸光系数的物理意义、两种表达形式及其相互关系。4.紫外-可见分光光度法单组分定量的各种方法。5.紫外-可见吸收光谱产生的原因，电子跃迁类型、吸收带的类型、特点。6.紫外-可见分光光度计的基本部件、工作原理。7.紫外-可见分光光度法对化合物定性鉴别、纯度检查及定量分析的基本方法。8.紫外光谱与有机物分子结构的关系。74 知识回顾酸的浓度常数：Ka=[H+][B-]/[HB]酸碱指示剂：为弱的有机酸或碱,其酸式和它的共轭碱具有不同的颜色,当溶液pH改变时，指示剂发生质子的转移引起结构上的改变而导致颜色的变化(如（甲基橙、酚酞等等）。吸收定律：A=εbc,注意每个符号代表什么？吸光度的加合性:如溶液中含有n中彼此不相互作用的组分，它们对某一波长的光都产生吸收，那么该溶液对该波长光吸光度A总等于溶液中各组分吸光度之和。A总=A1+A2+A3+…+An75 P168习题15（10min)76 习题15答案77'