分析化学 教学课件 作者 谢美红 李春 主编第九章 紫外-可见分光光度法.ppt

'第九章紫外-可见分光光度法1．能够说出分光光度法的特点2．知道吸收光谱的绘制方法及意义3．能够说出光的吸收定律、吸光系数的意义并学会有关的计算4．知道分光光度法中常用的定量分析方法并学会有关的计算5．能够说出紫外-可见分光光度计的基本结构学习目标 第一节概述根据待测物质发射或吸收的电磁辐射以及待测物质与电磁辐射的相互作用而建立起来的定性、定量和结构分析方法，统称为光学分析法。分光光度法即是其中的一种。在紫外光区(200～400nm)和可见光区(400～760nm)，根据待测物质对不同波长电磁辐射的吸收程度不同而建立起来的分析方法，称为紫外-可见分光光度法。 第一节概述紫外-可见分光光度法主要有如下特点：1.灵敏度高被测物最低浓度一般为10-5～10-6mol/L，适用于微量或者痕量组分分析。2.准确度高相对误差在1%～5%，对微量组分的分析已能满足要求。3.仪器设备简单、操作简便、测定快速由于采用选择性高的显色剂和适当的比色条件，可以不经分离干扰物质，即可直接进行测定，从而缩短分析时间。4.应用范围广几乎所有的无机离子和有机化合物均可直接或间接用紫外-可见分光光度法进行测定。 第一节概述一、光的本质与物质的颜色物质的颜色与光的组成和物质本身的结构有关。人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm。人的眼睛感觉不到的还有红外光（波长＞760nm）、紫外光（波长<400nm）、X射线等。几种光的波长范围 具有单一波长的光称为单色光。由不同波长的光组成的光称为复合光，它是是由各种不同颜色的光按一定强度比例混合而成。白光通过棱镜，便可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光，这两种单色光称为互补色光。第一节概述光的互补色示意图 物质的颜色是由于物质选择性地吸收了可见光中某一波长的光而产生的。当一束白光通过一溶液时，如果该溶液对各种颜色的光都不吸收，则溶液无色透明；如果完全吸收，则溶液显黑色；如果某些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光不被吸收而透过溶液，溶液的颜色就是它所吸收的光的颜色的互补色。第一节概述 二、光的吸收定律（一）透光率（T）和吸光度（A）当一束单色光照射到均匀而无散射的溶液时，假设I0为入射光的强度，Ia为溶液吸收光的强度，It为透过光强度，则：I0=Ia+It透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率，用符号T表示：第一节概述透光度率的负对数称为为吸光度，用A表示。 第一节概述（二）光的吸收定律实验证明，当入射光的波长一定时，溶液对光的吸收程度与该溶液的浓度和溶液的厚度有关。其定量关系服从朗伯-比尔定律，即当一束平行的单色光通过均匀、无散射的溶液时，在单色光波长、强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：A＝朗伯－比尔定律又称为光的吸收定律，是分光光度法定量分析的依据。但它只适用于稀溶液和单色光。在浓溶液或复合光时，误差较大。 三、吸光系数朗伯－比尔定律中的K称为吸光系数，是物质的特征常数之一。其物理意义是吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。当溶液的浓度选用不同的表示方法时，吸光系数的表示方法也不同。常用的表示方法有两种：第一节概述（一）摩尔吸光系数是指在波长一定时，吸光物质的溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸光度。常用表示。单位为L/(mol·cm) （二）百分吸光系数在药物分析工作中，应用较多的是百分吸光系数。是指在波长一定时，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml(1%)，液层厚度为1cm时的吸光度，单位为100ml/(g·cm)。常用表示。第一节概述摩尔吸光系数（）和百分吸光系数（）之间的换算关系是：=M为吸光物质的摩尔质量,其单位为g/mol。 第一节概述例9-1某化合物的摩尔质量为125g/mol，摩尔吸光系数2.5105L/(mol·cm)，配制该化合物溶液1L，将其稀释200倍，于1.00cm吸收池中测得其吸光度0.6000，问需要该化合物的质量是多少？解已知M=125g/mol=2.5105L/(mol·cm)L=1.00cmA=0.6000V=1L设需要该化合物的质量为x根据公式A=εcL得0.6000=2.5×105××1.00X=0.0600g答需要该化合物质量为0.0600g。 第一节概述例9-2用氯霉素（摩尔质量为323.15g/mol）纯品配制100ml含2.00mg的溶液，在1.00cm厚的吸收池中，于278nm波长处测得其吸光度为0.614，试计算氯霉素在278nm波长处的百分吸光系数和摩尔吸光系数。根据公式得==307[100ml/(g·cm)]A=0.614L=1.00cm根据公式得==307×=9920L/(mol·cm)答氯霉素在278nm波长处的百分吸光系数和摩尔吸光系数分别为307[100ml/(g·cm)]和9920L/(mol·cm)。解已知M=323.15g/mol=2.00mg/100ml=2.00×10-3g/100mlA=0.614L=1.00cm 吸光系数在一定条件下是一个常数，它与入射光的波长、溶质的本性以及溶液的温度有关，也与仪器的质量有关，它的数值越大，说明有色溶液对光越容易吸收，测定的灵敏度越高。一般ε值在103以上即可用于分光光度法的测定。不同物质对同一波长单色光可以有不同的吸光系数。同一物质对不同波长单色光也会有不同吸光系数。一般用物质最大吸收波长(λmax)处的吸光系数作为一定条件下衡量灵敏度的特征常数，因此，吸光系数是吸光光度法进行定性和定量分析的重要依据。第一节概述 四、吸收光谱吸收光谱又称吸收光谱曲线或吸收曲线，它是在浓度一定的条件下，以波长（λ）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，所绘制的曲线。曲线上吸光度最大的地方称为最大吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用λmax表示。第一节概述高锰酸钾溶液的吸收光谱曲线 从不同浓度KMnO4溶液的吸收光谱曲线可以看出：1．KMnO4溶液的λmax为525nm，说明其对波长525nm附近的绿色光有最大吸收，故KMnO4溶液显现绿色光的互补色即紫色。2．不同浓度KMnO4溶液在相同的波长范围内所形成的吸收峰高度不同。浓度越大，吸收峰越高，即吸光度越大。即吸光度的大小与浓度有关。这是分光光度法定量分析的依据。3．在相同条件下不同浓度的KMnO4溶液，其吸收光谱曲线的形状非常相似，最大吸收波长相同，说明吸收光谱的形状与溶液中溶质的结构有关。这是分光光度法定性分析的依据。4．当溶液的浓度、温度、液层的厚度一定时，溶液对λmax的光吸收程度最大。因此，常用λmax的光作为测定溶液吸光度的入射光，以获得较高的测定灵敏度。第一节概述 第二节分光光度法分光光度法是通过测定溶液对单色光的吸收程度来进行定性和定量的分析方法。分光光度法所用的仪器是分光光度计。一、分光光度计分光光度计根据所用的光源不同，可分为紫外分光光度计、可见分光光度计、红外分光光度计。由于紫外分光光度计和可见分光光度计的构造原理相同，常合并在一个仪器上，统称为紫外-可见分光光度计。在200nm～760nm波长范围内，能够任意选择不同波长的单色光来测定溶液吸光度的仪器，称为紫外-可见分光光度计。本节主要介绍紫外-可见分光光度计。 （一）基本结构紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、吸收池、检测器及信号显示系统五个部件组成。第二节分光光度法1.光源是提供入射光的部件。2.单色器是将光源发射的复合光色散分离出单色光的光学装置。3.吸收池是用于盛放分析液的器皿，也叫比色皿或比色杯。4.检测器是检测单色光通过溶液被吸收后透过光的强度，并把光信号转变为电信号的装置。5.信号显示系统是放大信号并以适当的方式显示或记录信息。 （二）基本类型1.可见分光光度计在实际工作中，常用722型可见分光光度计。国产722型可见分光光度计的外形如下图。第二节分光光度法234675891011.试样室盖2.数字显示屏3.确认键4.0%T键5.100%T键6.功能键7.波长读数窗8.波长旋钮9.试样室10.试样架推拉杆 2.紫外-可见分光光度计紫外-可见分光光度计根据光学系统不同分为单波长分光光度计和双波长分光光度计两大类。单波长又分为单光束分光光度计和双光束分光光度计。国产UV755B型分光光度计的外形如下图。第二节分光光度法123451.波长读数窗2.试样架推拉杆3.试样室盖4.数字显示屏确认键５.功能键 （三）722型可见分光光度计的使用方法1.接通电源，依次打开仪器开关和试样室盖，将选择开关置于“T”位，波长旋钮调整至测定所需波长值、灵敏度旋钮调至低位，预热30min。2.将空白溶液、标准溶液、待测溶液依次在仪器的样品架上放好。3.使空白溶液处于光路位置，调节“0”旋钮，使读数显示为“0.00”，盖上试样室盖，调节“100％”旋钮，使读数显示为“100.0”。4.反复调节“0”和“100％”旋钮，即打开试样室盖用零点调节钮调“0”，关闭试样室盖调“100％”，直至稳定不变。第二节分光光度法 5．盖上箱盖，依次拉出吸收池架推拉杆，将标准溶液、待测溶液置入光路，分别记录透光率读数。6．若测定吸光度A，将选择开关置于“A”位，调节“消光零”旋钮，使显示数字为“0.000”，然后将标准溶液、待测溶液移人光路，则显示的数值为吸光度。7．若测量浓度c，将选择开关旋至“c”，将标准溶液置于光路，调节“浓度”旋钮，使数字显示为标定值，将被测样品移人光路，即可读出被测样品的浓度值。8．测定完毕，关闭仪器开关，切断电源，将各旋钮恢复至原位，将比色皿清洗干净，置于滤纸上晾干后装入比色皿盒，罩好仪器。做好仪器使用记录。第二节分光光度法 二、定性、定量分析方法(一)定性分析方法1.比较吸收光谱的一致性在相同条件下，分别测定未知物和标准品的吸收光谱，比较二者的一致性。当没有标准物时，可以将未知药物的吸收光谱与《中华人民共和国药典》（2010年版，二部）中收录的该药物的标准图谱进行严格的对照比较。如果这两个吸收光谱特征，如形状、肩峰、吸收峰的数目、峰位和强度(吸光系数)等完全一致，则可以初步认为是同一化合物。但只有在用其他光谱方法进一步证实后，才能得出较为肯定的结论。因为官能团相同的物质，可能会产生非常相似、甚至相同的光谱曲线，所以，吸收光谱曲线相同不一定是同一种化合物。但如果这两个吸收光谱曲线的光谱特征有差异，则可以肯定不是同一种化合物。第二节分光光度法 第二节分光光度法2.比较吸收光谱的特征数据最大吸收波长（λmax）和吸光系数是用于定性鉴别的主要光谱特征数据。在不同化合物的吸收光谱中，最大吸收波长（λmax）可以相同，但因相对分子质量不同，百分吸光系数值会有差别。有些化合物的吸收峰较多，而各吸收峰对应的吸光度或百分吸光系数的比值是一定的，因此，也可以通过比较吸光度或百分吸光系数的比值的一致性，进行定性鉴别。 第二节分光光度法（二)定量分析方法朗伯—比尔定律是分光光度法定量分析的依据。被测溶液的吸光度与其浓度、液层的厚度之间符合A=KcL关系式。在符合光的吸收定律的条件下，选用λmax光作为入射光，对标准溶液和样品溶液在相同条件下测出它们的吸光度，即可计算出被测组分的含量。常用的方法主要有三种： 第二节分光光度法1．标准曲线法（1）配制标准系列取若干个相同规格的容量瓶，按照由少到多的顺序依次加入标准溶液，并分别加入等体积的试剂及显色剂，再加溶剂稀释至标线，摇匀备用。（2）配制样品溶液另取一个相同规格的容量瓶，精密吸取一定体积的原样品溶液，按照与标准系列相同的操作程序和实验条件，配制一定浓度的样品溶液。（3）测定标准系列和样品溶液的吸光度选择合适的参比(空白)溶液，在相同的条件下，以该溶液最大吸收波长(λmax)的光作为入射光，分别测定标准系列各溶液和样品溶液所对应的吸光度。 第二节分光光度法（4）绘制标准曲线根据测定结果，以标准溶液浓度(c)为横坐标，所对应的吸光度(A)为纵坐标，绘制吸光度-浓度曲线，称为标准曲线，也称为工作曲线或A-c曲线。（5）计算原样品溶液的浓度根据测定的样品溶液的吸光度，在标准曲线上的纵坐标上找到样品的吸光度（A样），再在标准曲线的横坐标上确定所对应的样品溶液的浓度(c样)。用下式计算原样品溶液的浓度(c原样)。c原样＝c样×稀释倍数使用标准曲线法一般要用4～7个标准溶液，其浓度范围应在溶液的吸光度与其浓度呈线性关系的区间内，且溶液的吸光度最好控制在0.2～0.8范围内。 第二节分光光度法如果标准系列的浓度适当，测定条件合适，那么理想的标准曲线就是一条通过坐标原点的直线（见下图）。在实际工作中，很多因素可能导致A偏离光的吸收定律，常出现标准曲线在高浓度端发生弯曲现象，给测定结果带来误差（见下图）。标准曲线（A-c曲线）偏离光的吸收定律示意图 第二节分光光度法2．标准品对照法在相同的条件下，配制浓度为c标的标准溶液和浓度为c样的样品溶液，在最大吸收波长λmax处，分别测定二者的吸光度值为A标、A样，依据朗伯-比尔定律，A标=K标c标L标A样=K样c样L样。由于用的是同一种物质、同一台仪器、相同厚度的吸收池在同一波长处测定，因此再根据稀释倍数求出原样品液的浓度：c原样＝c样×稀释倍数为了减少误差，标准品对照法配制的标准溶液浓度常与样品溶液的浓度相接近。 第二节分光光度法例9-3精密吸取KMnO4样品溶液5.00ml，加蒸馏水稀释至25.00ml。另配制KMnO4标准溶液的浓度为25.0μg/ml。在λmax=525nm处，用1cm厚的吸收池，测定样品溶液和标准溶液的吸光度分别为0.220和0.250，求原样品溶液中KMnO4的浓度。解已知A标=0.250A样=0.220c标=25.0μg/ml根据公式得根据公式c原样＝c样×稀释倍数得c原样＝c样×稀释倍数=(μg/ml)答原样品溶液中KMnO4的浓度为110μg/ml。 第二节分光光度法3.吸光系数法吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式A＝KcL进行计算的定量分析方法。在相关的手册中查出待测物质在最大吸收波长λmax处的吸光系数（、），并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度可根据以下公式计算：或 第二节分光光度法例9-4维生素B12的水溶液在=361nm处的百分吸光系数=207[100ml/(g·cm)]。若用1cm的吸收池，测得维生素B12样品溶液在361nm波长处的吸光度A=0.621，试求该溶液的质量浓度。解已知=207[100ml/(g·cm)]L＝1.00cmA=0.621根据公式得(g/100ml)答该溶液的质量浓度为0.00300g/100ml。 达标测评一、名词解释1．工作曲线2．吸收光谱曲线3．最大吸收波长4．光的吸收定律5．摩尔吸光系数6．百分吸光系数 达标测评二、单项选择题1.有色物质的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是（）。A.增加、增加、增加B.减小、不变、减小C.减小、增加、增加D.增加、不变、减小E.减小、不变、增加2.某浓度的溶液在1cm吸收池中测得透光率为T，若浓度增大1倍，则透光率为（）。A．T2B．T/2C．2TD．E．2 3.以下说法错误的是（）。A.吸光度随浓度增加而增加B.吸光度随液层厚度增加而增加C.吸光度随入射光的波长减小而增加D.吸光度随透光率的增大而减小E.在λmax处溶液的吸光度最大达标测评 4.下列关于吸收光谱曲线的描述中，不正确的是（）。A.吸收光谱曲线表明了吸光度随波长的变化情况B.吸收光谱曲线以波长为纵坐标，以吸光度为横坐标C.吸收光谱曲线中，最大吸收峰处的波长为最大吸收波长D.吸收光谱曲线表明了吸光物质的光吸收特性E.同一物质不同浓度的溶液吸收光谱曲线的形状相似，最大吸收波长相同达标测评 达标测评5.用1cm吸收池测定某有色溶液的吸光度为A，若改用2cm吸收池，则吸光度为（）。A.2AB.A/2C.AD.4AE.3A6.吸收光谱曲线是（）。A.吸光度（A）-时间（t）曲线B.吸光度（A）-波长（λ）曲线C.吸光度（A）-浓度（c）曲线D.吸光度（A）-温度（T）曲线E.吸光度（A）-质量（m）曲线 达标测评7.分光光度法中的标准曲线是（）。A.吸光度（A）-时间（t）曲线B.吸光度（A）-波长（λ）曲线C.吸光度（A）-浓度（c）曲线D.吸光度A）-温度（T）曲线E.吸光度（A）-质量（m）曲线8.下列说法正确的是（）。A.吸收曲线的基本形状与溶液的浓度无关B.吸收曲线与物质的特性无关C.溶液的浓度越大，吸光系数越大D.溶液的颜色越浅，吸光度越大E.溶液的浓度越大，最大吸收波长越大 达标测评三、填空题1．已知某有色配合物在一定波长下用2cm吸收池测定时其透光率T=0.60，若在相同条件下改用1cm吸收池测定，吸光度A为_______；用3cm吸收池测量，透光率T又为_______。2．测量某有色配合物的透光率时，若吸收池厚度不变，当有色配合物浓度为c时的透光率为T，当其浓度变为原来的三分之一时的透光率为_________。 达标测评3．吸收曲线上吸光度最大的地方称为_________，它对应的波长称为_________，吸收曲线的_________和_________与物质的分子结构有关，因此，吸收曲线的特征可作为对物质进行_________的基础。4．对于同一物质的不同浓度溶液来说，其吸收曲线的形状_________，最大吸收波长_________，只是吸收程度_________，表现在曲线上就是曲线的_________。 达标测评四、计算题1．药物卡巴克洛的摩尔质量为236g/mol，将其配成每100ml含0.4962mg的溶液，盛于1cm吸收池中，在λmax为355nm处测得A值为0.557，求卡巴克洛的摩尔吸光系数。2．已知一溶液在λmax处为1.40×104L/(mol·cm)，现用1cm吸收池测得该物质的吸光度为0.85，计算该溶液的浓度。 3．已知KMnO4溶液的摩尔吸光系数为2.2×103L/(mol·cm)，KMnO4的摩尔质量为158g/mol，求将质量浓度为0.02g/L的KMnO4溶液放在3cm吸收池中测得的吸光度是多少？达标测评 第九章紫外-可见分光光度法本章结束，谢谢大家作者接明军'