基于脉动变光程的分光光度法自标定检测磷酸盐.pdf

'第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第4期2012年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry622～625DOl：l0．3724／SP．J．1096．2012．11052基于脉动变光程的分光光度法自标定检测磷酸盐叶树明1,2汤亚伟1,2高丹蒋凯(浙江大学生物医学工程教育部重点实验室’，生物医学工程与仪器科学学院，杭州310027)(中国船舶重工集团公司第七一一研究所，上海201108)摘要分光光度法应用于磷酸盐长期监测存在络合物对透光窗口附着污染的干扰问题。本研究采用新的脉动变光程的分光光度检测原理，提出自标定检测方法，开发了脉动可变光程的机械装置。利用此设备实现了水体磷酸盐检测的长期原位自标定。利用本方法与传统分光光度计进行长期监测对比实验，结果表明：本方法能够有效去除镜头附着污染等干扰因素影响，提高了检测结果的准确性与可靠性。关键词分光光度法；磷酸盐；脉动变光程1引言磷是生物能量传输和动植物、浮游生物生长必需的营养要素，水体中的氮和磷的浓度及其比值显著影响浮游植物的丰度及种类。磷的生物可利用性可能直接影响到全球海洋初级生产力水平]。因此，磷酸盐含量是生物地球化学过程的关键参数，而活性磷酸盐是研究磷在水体中循环的最关键参数。目前，实验室的活性磷酸盐检测方法主要有磷钼黄分光光度法、磷钼蓝(Phosphomolybdenumblue，PMB)分光光度法及流动注射分光光度法等_2]。由于在磷酸盐长期在线监测过程中，有色络合物会累积附着在透光窗口上，导致测量得到的透射光强度减弱，从而使检测结果偏离标定曲线，产生检测误差。克服有色络合物附着污染的有效方法是对仪器进行定期标定。但长期在线标定存在以下的问题：(1)现场环境一般难以在线标定，并且标准溶液也难以在线长期保存；(2)标定只能保障特定时刻数据检测的准确性，而无法保障介于两次标定之间的检测数据的准确性。已有研究者基于改进试剂的保存状态和条件，解决了传统分光光度法所需的试剂保存有效期较短的问题[5～，但是并没有解决络合物附着污染带来的干扰问题。有研究者提出在数据处理中对监测数据进行线性补偿的方式，去除在长期监测中因有色络合物污染透光窗口导致光强减弱的干扰删。但是这种方法只对特定场所的匀速渐变附着有效，而现场络合物附着往往是阶段性突变过程，所以该补偿方法不具有通用性。再者，络合物在透光窗口沉积与磷酸盐样品浓度及检测频率有关。因此，该线性补偿的方法并不能实质解决干扰问题。针对活性磷酸盐长期原位监测问题的瓶颈，本研究提出一种新的方法——脉动变光程检测，即将分光光度检测的光程分为多等分的脉动量，当检测光程变化一个或多个脉动量时，检测装置动态记录测量的吸光量。该原理引入一个稳定的检测光程变化量△L，而测量的吸光量的变化量仅与△L、待测物浓度与吸光常数相关。因此，其它干扰因素，如光源漂移、有色络合物附着等，则可视为不变量被除去。2检测原理如果在较短时间内，改变检测光通过待测物的吸光光程(L)，也就是恒压改变检测容腔的容积，而保持待测物温度、压力、浓度(c)等不变，由于络合物附着扰动是一个相对长期缓慢变化过程，因此在前后相邻的检测过程中可视为不变量。则脉动变光程后待测物的光程变化了△L。根据朗伯一比尔定律，上述过程可表示为：2=Jo·P一‘△L·PAAA(1)其中，I。为人射光强，，为光程变化后检测到的透射光光强，￡为摩尔吸光系数，e，c和L分别是因污201卜09-16收稿；201l一1卜O7接受本文系国家自然科学基金(No．40906050)和中央高校基本科研业务费专项资金(No．2010QNA5023)资助E-mail：arkie@zju．edu．cn 第4期叶树明等：基于脉动变光程的分光光度法自标定检测磷酸盐623染引入的干扰量。式(1)经变换可以得到：△A—ln(笔)一￡·c·△L(2)式中，△A为吸光度差，为光程变化前检测到的透射光光强，对公式(2)变换可以得到：c一△A／(eAL)(3)由公式(3)可知，当前的待测物浓度c只与△A，e，△L这几个变量相关，即该方法在每一次检测过程中，实现了自标定。因此根据公式(3)建立标准曲线，可以成功消除络合物附着干扰对检测的影响。3实验部分3．1仪器与试剂CHEM4一VIS—FIBER分光光度计(Oceanoptics)；脉动变光程分：光度系统(自制，图1)。CHEM~VIS-FIBER分光光度计覆盖430--990am的光谱范围，光学分辨率为1．0nm，通过RS232串行接口可将光强数据发送给数据接收端。cl{EM4_VIs—FIBER通过准直镜和光纤，可以实现将其光源和探测器应用于脉动变光程分光光度系统。6．0mol／LHSO(分析纯)；钼酸铵溶液：溶解28g钼酸铵(分析纯)于200mL水中；酒石酸锑钾溶液：溶解6g酒石酸锑钾(分析纯)于200mL水中，贮于聚乙烯瓶中；．混合溶液：边搅拌边将45mL钼酸铵溶液加到200mL6．0mol／LH：SO中，加入5mL酒石酸锑钾溶液，混匀，贮于棕色玻璃瓶中；抗坏血酸溶液：溶解2Og抗坏血酸(分析纯)于200mL水中，盛于棕色聚乙烯瓶中；磷酸盐标准贮备溶液(O．300g／LP)：称取1．318g6．0mol／LKH2PO4(优级纯)溶于10mL6．0mol／LH2SO及少量水中，全量转人1000mL量瓶，定容，混匀，再加1mL三氯甲烷(分析纯)；磷酸盐标准使用溶液(3．O0mg／LP)：量取1．O0mL磷酸盐标准贮备溶液至tO0mL量瓶中，定容，混匀，加两滴三氯甲烷。3．2脉动变光程分光光度系统脉动变光程(PVOPL)分光光度系统主要由注射泵、多通阀、反应池、废液袋和脉动变光程装置组成，如图1所示。系统通过注射泵和多位阀配合完成试样的引入、预处)里、反应和检测等。采用自制的脉动变光程装置，利用CHEM4一VIS-F]BER分光光度计的光源和检测器，完成浓度的检测。如图1B所示，CHEM4一VIS—F’IBER分光光度计的光源和检测器分别通过光纤经过中空管8、9连接至准直镜14、15。光线依次经过有机玻璃窗l0、待测液腔3、有机玻璃5、空白液腔4和有机玻璃窗I1组成的光程固定的光程池(设计长度300mm)。有机玻璃5和有机玻璃窗10之间为待测液腔，有机玻璃5和有机玻璃窗11之间为空白液腔。步进电机转动时，通过丝杆螺纹带动固定有有机玻璃5的套筒移A⋯⋯⋯～⋯⋯⋯一一B图1脉动变光程分光光度系统Fig．1Pulsatingvariableopticalpathlength(PVOPL)spectrophotometricsystemA-S．样品(Sample)；R．试剂(Reagent)；SV．多位选择阀(Multipositionvalve)；s注射泵(Syringpump)；RC．反应池(ReactorCel1)；废液(Waste)；E{：LS．光源(Lightsource)；D．检测器(Detector)；l，2．待测／空白液出人口(Sample／Blankinlet／Outlet)；3,4．待测／空白液腔(Sample／Blankcel1)；5有机玻璃(Organicglass)；6．步进电机(Steppermotor)；7．丝杆(Screwrod)；8，9．中空柱塞(Hollowplunger)；10,11．有机玻璃窗(Organicglasswindow)；12，13．密封圈(O-Ring)；14,15．准直镜(Collimator)。 624分析化学第4O卷OOO动，改变待测液腔3和空白液腔4的大小，从而改变待测液光程。步进电机的动作通过微控制器控制。加控制软件将光程池分为10等分，最小光程差为30mm。3．3检测方法和步骤3．3．1磷钼蓝分光光度法在酸性介质中，活性磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼黄，用抗坏血酸还原为磷钼蓝后，于882nm波长测定吸光值。首先将SV1连通①③，由注射泵吸入试剂，再将SV1连通①④，由注射泵将试剂注入反应池。然后将SV1连通①②，由注射泵吸人待测液，再将SV1连通①④，将待测液注入反应池，充分反应后，将SV2连通①③，利用脉动变光程装置进行检测。检测完毕后，将SV2连通②③，脉动变光程装置将液体排出到废液袋中。3．3．2绘制标定曲线量取0，1．00，1．50，2．00，2．50，3．00和3．50mL磷酸盐标准溶液于50mL带刻度具塞比色管中，定容得到7个浓度梯度的磷酸盐标准液。上述溶液各加1．0mL混合溶液，1．0mL抗坏血酸溶液，混匀。显色5min后，利用脉动变光程装置进行测量，空白溶液为蒸馏水。控制步进电机，在某一浓度下，测量光程在L。处的吸光值A。和光程在L。处的吸光值A，取△Ai—AI-A。。以△A为纵坐标，相应的磷酸盐浓度(mg／L)为横坐标，绘制标准曲线。4结果与讨论一广I暑一4．1不同光程差的吸光值差对标定曲线的影响由于在理论光程L。===0cm和最大光程L。一3cm时，有机玻璃5分别和有机玻璃10、II完全接触，实际机械设计和步进电机等因素会存在不稳定的临界状态。所以，初始光程L。(0cm)和最大光程L。。(10cm)处的透射光值均未被作为有效数据处理。因此分别取△L一L一L一1．5cm一0-3cm===1．2cm和AL一L9一L。一2．7cm一0．3cm一2．4cm，按实验方法绘制标定曲线，如图2所示。不同的光程差，其标定曲线的线性度都很好。但是，当利用较大的光程差进行标定时，相同样品浓度得到的吸光度差值更大，因此会有更低的检出限。但是由于光程大，所能检测的线性范围变窄，检测浓度上限变低。已知光程差△L：和△L为2倍关系，而两条拟合直线的斜率对比也为2倍关系，说明标定结果的一致性很好。4．2长期监测的稳定性和准确性分析分别利用普通分光光度计和脉动变光程分光光度系统对0．24mg／L磷酸盐标准溶液进行测量，每天测量一次，持续16d，测量结果如图3所示。从图3可见，普通分光光度计的检测结果发生了明显的偏移，而脉动变光程分光光度系统的检测结果则保持在固定的检测精度范围内。此外，标准检测方法的前期，偏移量与时间呈线性关系；后期发生了突变现象，这进一步说明了采用线性补偿方法的局限性。00．O50．1O．15O-200_250．3Oc(mgn3图2不同光程差的标定曲线图3长期测量对比实验结果Fig．2Calibrationcurveofdifferentopticalpathdiffer-Fig．3Comparsionoflong-termmeasurementresultsences对标准溶液测量结果进行空白加标回收率计算，0．24蝉的标准溶液连续测量16次，RSD为1．，回收率为100％。以浙江大学西溪校区池塘水作为实际样品进行测量，络合物污染后的CHEM4-VIS—FIBER分光光度计和脉动变光程分光光度系统的测量结果如表1所示，样品的测量结果为0．044mg／L。 第4期叶树明等：基于脉动变光程的分光光度法自标定检测磷酸盐625表1西溪校区池塘水样品测量结果Table1MeasurementresultsofpondⅥaterfromXixicampusMethodI：本方法(Thismethod)；MethodⅡ：分光光度法(spectrophotometry)。两组测量结果如图4所示。：i芏标准比色皿受络合物污染后，由于大部分光强被络合物吸收，若不重测量次数Numberofmeasurements新标定，测量值会出现严重偏差。但是脉动变光程图4西溪校区池塘水样测量结果分光光度系统由于具有自标定功能，可以有效消除Fig．4MeasurementresultsofpondwaterfromXixicampus因络合物污染而产生的干扰。References1SmithSV．l【L广Iim吕n一oI110．一O扫IcIea0In10ougr．，1984，29(6)：1149～11602StateOceanicAdministrationofChina．CriterionofOceanicMonitroing．Beijing：Ocean1c’ress，1991，179：277～281国家海洋局．海洋监测规范．北京．海洋出版社，1991，179：277~2813StateEnvironmenta1Protection~dministrationofChina．AnalysisMethodsofWaterandWastewater．BeijingChinaEnvironmenta1SciencePress，2002：246～248国家环境保护总局．水和废水监测分析方法．北京：中国环境科学出版社2002：246～2484FangZhao～Lun．FlowInjectionAnalysis．Beijing：SciencePress，1999：：S方肇伦．流动注射分析法．北京：科学出版社，1999：85BowdenM，SequieraM，KrogJP，GravesenP，DiamondD．Analyst．，2002，127(1)：1～46BowdenM，DiamondD．SensorsandActuatorsB，2003，90(1)：17O～147CrowleyK，FrisbyJ，MurphyS，RoantreeM，DiamondD．SensorsandActuatorsA，2005，122(2)：222～2248McGrawCM，StitzelSE，ClearyJ，SlaterC，DiamondD．Talanta，200,7，71(3)：]18O～1185SpectrophotometricDeterminationofC’rth0phOsphateBasedonPulsatingVariableOpticalPathLengthandSelf-CalibrationTechniqueYEShu-Ming，TANGYa—Wei，GAODan。，JIANGKai(KeyLabofBiomedicalEngineeringofMinistryofEducation，Hangzhou310027，China)(CollegeofBiomedicalEngineel’ing&InstrumentScience，ZhejiangUniversity，Hangzhou310027，China)。(ShanghaiMarineDieselEngineResearchInstitute，Shanghai201108，China)AbstractThereisinterferenceproblemcausedbythecomplexesstainingtr．ansparentwindow，whenspectrophotometryisappliedLolong—termmonitoringorthophosphate．Anewself—calibratingdetectionspectrophotometricmethodbasedonpulsatingvariation·3fopticalpathlengthwasproposedforrealizingthelong—termmonitoringoforthophosphate．Thedevicewithpulsatingvariationofopticalpathlengthwasdevelopedtoimprovethetraditionalspectrophotometry．Theresultsofthecomparativeexperimentsshowthatthenewsystemcaneffectivelyeliminatetheinterferenceofthecomplexesstainingonthetransparentwindowandimprovetheaccuracyandreliability．KeywordsSpectrophotometry；Orthophosphate；Pulsatingvariati·Dnofopticalpathlength(Received16September2011；accepted7November2O11)'