基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸.pdf

'第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2014年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry542～546DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．31084基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸邓小燕李佳渝谭克俊(发光与实时分析教育部重点实验室，西南大学化学化工学院，重庆400715)摘要在pH7．3磷酸盐缓冲介质中，通过静电作用，叶酸能猝灭碳量子点在384am处的荧光。其猝灭的荧光信号强度与叶酸浓度呈一定线性关系，据此建立了检测叶酸的荧光分光光度法。线性范围为0．025—2．0~mol／L，相关系数为0．9947，检出限为2．5nmol／L。表征了体系的荧光光谱，吸收光谱及荧光寿命，探讨了体系的反应机理，优化了实验条件。本方法用于模拟血清中叶酸含量的检测，加标回收率为97．3％一101．6％，RSD≤4．9％。关键词荧光分光光度法；叶酸；碳量子点1引言叶酸(Folicacid，FA)作为一种水溶性B族维生素，是细胞分裂、生长不可缺少的物质。所有生长发育或新陈代谢旺盛的组织也均需要有足够的叶酸_lJ。若叶酸不足，细胞的再生就会受到阻碍，引起巨幼红细胞贫血；此外，还会导致头发变灰、舌头发炎、肠胃不适、智力退化。而孕妇缺乏叶酸，可能引起胎儿宫内发育迟缓、早产和低体重出生等。叶酸在生命体中扮演着如此重要的角色，因此对叶酸的分析检测具有十分重要的意义。现有对叶酸的检测方法主要包括分光光度法J、微生物法J、等离子发射光谱法]、气相色谱法5]、高效液相色谱法等，在众多检测方法中，荧光分光光度法由于其简单、灵敏及成本低等优点，广泛用于体系中待测物质的分析检测"J。到目前为止，通过合成各种纳米材料(NPs)用于检测叶酸的报道并不多，其中Geszke等合成了水溶性的Mn：ZnS／ZnS量子点(QDs)，基于FA与QDs作用导致其荧光强度降低实现了叶酸含量的测定；Gudarzy等报道了基于Y：O，：Eu纳米材料来检测叶酸；Liu等。。合成了水溶性的CulnS量子点，基于荧光猝灭．恢复实现对叶酸含量测定。近年来，碳量子点(Carbonquantumdots，CQDs)作为一种新型荧光纳米材料受到越来越多的关注。由于其具有荧光强度高、光稳定性好、耐光漂白、低毒性、生物相容性好¨等优点广泛应用于各个分析领域。本研究合成了一种水溶性好，荧光强度高，耐光漂白的CQDs_l，探讨了CQDs与FA的相互作用关系。研究发现，FA能使CQDs的荧光猝灭，其猝灭程度与FA的浓度具有一定的线性关系，据此建立了检测FA的荧光分光光度法。本方法简单，快速，灵敏度高。2实验部分2．1仪器与试剂F-2500荧光分光光度计(日本13立公司)，U-3010紫外．可见分光光度计(日本日立公司)，25mL对位聚苯(Polyphenyl，PPL)水热反应釜(上海岩征实验仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；H1650．W台式微量高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，ZEN-3690电位分析仪(马尔文仪器有限公司)。叶酸储备液：准确称取叶酸标准品(成都市科龙化工试剂厂)22．1mg，用超纯水溶解并定容至250mL，得到2．0xl0mol／L叶酸储备液。0．2mol／LNaH2PO4一Na2HPO4缓冲溶液(PBS)；30％H202、NaOH、甲醇(重庆川东化工(集团)有限公司)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，国药集团化学试剂有限公司)；C印(阿拉丁，纯度>99．9％)。试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。2013-08-23收稿；2013—12-27接受本文系国家自然科学基金项目(No．21377103)资助E—mail：tankj@swu．edu．cn 第4期邓小燕等：基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸5432．2实验方法2．2．1碳点的合成采用一步水热法合成碳量子点13]。取10mgC∞于25mLPPL水热反应釜中，加入0．1gCTAB，0．1gNaOH，1001％H202，5．9mL超纯水。于150oC反应1h，待反应釜自然冷却后，得到棕黄色溶液，12000r／min离心10min后，取上清液转移到4mLEppendof(EP)微量离心管内，待用。2．2．2叶酸含量的检测在比色管中分别加入PBS缓冲溶液(pH7．3)200／xL，碳量子点lO(4．5L)，再加入适量叶酸标准液，定容至2mL，静置20rain，每加入一种物质后均漩涡混匀，于F-2500荧光分光光度计上，以320nm光激发，扫描发射光谱，测定位于384nm处的荧光。2．2．3样品预处理空腹采取人的静脉血12000r／min离心20rain。取上清液1mL，加入500IxL叶酸(2．0×104moL／L)，再加入2mL甲醇，漩涡30s，5000r／min离心10min去除蛋白质。取其上清液定容至20mL，用于模拟血清中FA含量的测定。3结果与讨论3．1光谱特征CQDs与FA相互作用的荧光光谱图如图1。从图1可见，CQDs最大的发射峰在384nm处；随着FA的加入，384nm处的荧光强度逐渐减弱，这是由于在PBS缓冲溶液(pH7．3)中，FA与CQDs通过静电作用，使得荧光发生猝灭，其猝灭强度与FA浓度呈一定的线性关系，据此可实现FA的定量检测。3．2叶酸对碳量子点的机理探讨3．2．1主要作用力由于使用了阳离子表面活性剂CTAB，使得合成的CQDs表面带正电¨。在pH7．3条件下，实验测得FA加入前后CQDs的Zeta电位分别为9．96和8．18mV。因此认为，在pH7．3条件下，带负电的FA与带正电的CQDs的结合，是静电作用的结果。3．2．2紫外吸收和荧光寿命由紫外吸收光谱图(图2)可见，FA在280Fin处有一个吸收峰，但CQDs未见明显的吸收峰。当FA与CQDs作用后，体系的吸收峰发生改变，且在370Fin处出现一个新峰，推断FA对CQDs的猝灭可能为静态猝灭。因为动态猝灭只影响荧光分子的激发态，而并不改变荧光物质的吸收光谱_1"]。实验测得CQDs加入FA前后的荧光寿命(．r)分别为0．349和0．348as，表明FA的加入对CQDs的荧光寿命几乎无影响(图3)，即FA对CQDs的猝灭非动态猝灭，而是静态猝灭¨。图1FA与CQDs作用的荧光光谱图2FA，FA-CQDs，CQDs的uV光谱Fig．1Fluorescencespectraoffolicacid(FA)andFig．2UVspectraofFA．FA-CQDsandCQDsc~bonquantumdots(CQDs)pH7．3；CCQD，22．5mg／L．pH7．3；CCQD，22．5mg／L；CVA(Curves1—6)，0，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0Ixmol／L．3．2．3温度对淬灭常数的影响为了进一步证明淬灭机理，探讨了温度对淬灭常数的影响。Stern．Volmer方程常被用于区分动态猝灭和静态猝灭¨：／=1+[Q]其中，和F分别表示加人猝灭剂前后CQDs的荧光强度，[Q]表示FA的浓度，K称为Stern—Volmer猝灭常数。图4是3个温度下Stem．Volmer方程的／F对[Q]关系图，求得猝灭常数K分别为 544分析化学第42卷19．3x10L／tool(15qC)，11．98x10L／tool(30℃)和8．35x10L／tool(50qC)，可见K随温度升高而降低，且它们的猝灭常数远大于100L／tool。由此推断FA对CQDs的猝灭是静态猝灭，这与紫外吸收，荧光寿命的实验结果是相符合的。虽然FA有荧光性能，但CQDs的发射光谱和FA的吸收光谱无重叠，FA不会与CQDs发生能量共振转移。因此，FA对CQDs的猝灭机理为静态猝灭。图3CQDs加入FA前后的荧光衰减图图4不同温度下的Stern—Volmer方程Fig．3FluorescencedecaydiagramofCQDsbeforeandFig．4Stern—VolmerplotsatdifferenttemperaturesafteraddingFApH7·3；CCQD，17·5mg／L．pH7．3；CCQD，22．5mg／L．3．3反应条件的选择考察了加样顺序对体系的影响，按PBS缓冲溶液、CQDs、FA的顺序加样，反应的信噪比最高。此外，分别考察了Tris—HC1，BR，PBS缓冲溶液对体系荧光强度的影响，选用PBS缓冲溶液体系的响应信号最稳定且最强，故选择PBS缓冲体系。研究了碳量子点浓度及pH值对体系荧光强度的影响。分别取不同浓度的碳量子点与一定浓度的FA反应，结果表明，CQDs的浓度太低时，荧光猝灭不明显，线性范围窄；而CQDs浓度太高时，分析灵敏度低。为兼顾灵敏度和线性范围，实验选取CQDs浓度为22．5mg／L。图5是pH值的影响，CQDs体系在pH6．6～7．6范围内荧光较强。当pH<6．6时，CQDs易发生质子化，导致荧光强度降低；当pH>7．6时，随着碱性的增强，CQDs易发生去质子化，也会导致荧光强度降低。加入FA后，体系在pH7．2～7．4处荧光猝灭效果最好，因此选择PBS缓冲溶液(pH7．3)控制反应酸度。除此之外，还研究了离子强度对体系荧光强度的影响及时间稳定性。如图6可知，体系荧光强度随着NaC1浓度的增大而增强。这是由于加入NaC1后，CQDs的亲水性基团与NaC1之间的相互作用使得非辐射衰变减弱，体系的CQDs聚集程度增大，荧光强度增强_1’]。在室温下，体系在20min后即可达到稳定，稳定时间可达到60rain。基于以上原因，本研究选择不加NaC1溶液，体系反应20rain后测定。c~．f(mollL)图5pH值的影响图6离子强度的影响Fig．5EffectofpHonfluorescenceintensityFig．6EffectofionicstrengthonfluorescenceintensitycCQI)，22．5mg／L；CFA，1Ixmol／L．pH7．3；cCQI)，22．5rag／L；FA，1IxmolZL． 第4期邓小燕等：基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸5453．4分析参数在优化的实验条件下，不同浓度FA后的荧光光谱变化见图7。体系在384Bin处的荧光猝灭强度与FA浓度在0．025～2．0i~moL／L范围内呈线性关系，线性回归方程为一F=1793．2c(p~moL／L)+110．2，相关系数为0．9947，检出限为2．5nmol／L。3．5共存物质影响在优化的实验条件下，考察了常见糖类、氨基酸、无机盐等共存物质对体系的影响，结果见表1。实验发现，常见的糖类、氨基酸、无机盐对体系的影响较小，Fe对体系的干扰相对较大，但是不影响实际样品的测定。在最佳优化条件下，只有FA在该条件下有很好的响应。说明体系对FA的选择性好。3．6样品分析在优化的条件下，检测模拟血清样品中FA含图7CQDs与FA作用的荧光曲线图量，每个样品平行测定5次。通过标准加入法测定了Fig．7FluorescencecurveofCQDsupontheadditionof回收率和相对标准偏差，结果见表2，样品的回收率在differentconcentrationsofFA97．3％～101．6％之间，相对标准偏差小于4．9％。pH7．3；CCQD，22．5mg／L．表1共存物质影响Table1ToleranceofforeignsubstancesS共存物c。薏辇物c。i。雪ubstances“S一es“(~％rt-o)rK．(C1)7000．76苯丙氨酸Phenylalanine5．04．8Ca“，(C1一)300_JD．17酒石酸Tartaricacid7．54．3Mg，(C1)70-2．66抗坏血酸Ascorbicacid10．01．1Fe¨．(C1)13．74柠檬酸Citricacid7．5—1．2Ni．(Cr)751．14谷氨酸Glutamicacid5．0-4．9Co“，(sol一)702．16葡萄糖glucose7．50．3cr3，(sOj一)5．0-2．53蔗糖Sugar3．5_4．8Ba，(s0一)84．32丝氨酸Serine50．0—1．8Cu“．(C1)5-1．25环糊精Cyclodextrin7．02．7NO，(Na)102．61精氨酸Arginine5．01．8sol，(Na)500．96苏氨酸Threonine5．02．3亮氨酸Leucine5-4．2组氨酸Histidine7．00．27表2模拟血清样品分析结果及回收实验Table2AnalyticalresultsandrecoverytestsofFAinsimulatedhumanserumsamplesReferences1LucockM．Mo1．Genet．Metab．，2000，71(1．2)：121—1382YELi，TIANYi·Mei．TianfinPhamacy，2000，12(3)：63—64叶立，田义梅．天津医学，2000，12(3)：63—643HAOLing，ZHENGJun—Chi，TIANYi—Hua，FANDa—Wei，LIZhu．JournalofPepekingUniversity(HealthSciences)，2004，36(2)：210—214郝玲，郑俊池，田熠华，范大伟，李竹．北京大学学报(医学)，2004，36(2)：210—214 分析化学第42卷4WANGWei，SUNWei—De．ChineseAna1．Chem．，2003，31(10)：1280王伟，孙伟德．分析化学，2003，31(10)：12805WENXiao—Qing，YANGYue—Xin．ChineseJournalofFoodHygiene，2004，16(1)：65—70文小青，杨月欣．中国食品卫生杂志，2004，16(1)：65—706LONGChao·Yang，GAOHong—Yan，XUXiu—Min，LIANGFu—Rong，LIANGChan—Hui．ChineseAna1．Chem．，2004，32(10)：1341—1344龙朝阳，高艳红，许秀敏，梁富荣，梁春穗．分析化学，2004，32(10)：1341—13447ZHOUFu—Lin，SONGShao—Fei，GONGQiao—Juan，ZHANGWen·Can，WANGTian—Jiao．JournalofInstrumentalAnalysis，2010，29(3)：272-275周福林，宋少飞，弓巧娟，张稳婵，王天娇．分析测试学报，2010，29(3)：272—2758GeszkeM，MuriasM，BalanL，MedjahdiG，KorczynskiJ，MoritzM，LulekJ，SchneiderR．Acta．Biomater．，2011，7(3)：1327—13389GudarzyF，MoghaddamAB，MozafariS，GanjkhanlouY，KazemzadM，ZahedR，BaniF．Microchim．Acta．，2013，180(13—14)：1257—126210LiuSY，HuJJ，SuXG．Analyst，2012，137：4598-460411YuSJ，KangMW，ChangHC，ChenKM，YuYC．Am．Chem．Soc．，2005，127(50)：17604—1760512XuXY，RayR，GuYL，PloehnHJ，GearheartL，RakerK，ScrivensWA．Am．Chem．Soc．，2004，126(40)：12736-1273713GaoMX，LiuCF，wuzL，ZengQL，YangXX，wuWB，¨YF，HuangCZ．Chem．Commun．，2013，49：8015—8017XUJin—Gou，WANGZun—Ben．FluorometricAnalysisMethod．Beijing：SciencePress，2006：64—70许金钩，王尊本．荧光分光法．北京：科学出版社，2006：64—7015LakowiczJR．New】‘9：Springer，2006：208-28216MopelolaI，EmmanuelL，TebelloN．Photochem．Photobio1．A，2008，198：7—1217YANGMan—Man，YANGPin，ZHANGLi—Wei．Chin．Sci．Bul1．，1994，39(1)：31-35杨曼曼，杨频，张立伟．科学通报，1994，39(1)：31—35JiaXF，LiJ，WangEK．Small，2013，9(22)：3873—3879CarbonQuantumDots-BasedFluorescenceSpectrophotometricAssayofFolicAcidDENGXiao—Yan，LIJia—Yu，TANKe—Jun(EducationMinistryKeyLaboratoryonLuminescenceandReal—TimeAnalysis，CollegeofChemicalandChemistryEngineering，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China)AbstractInNaH2PO4-Na2HPO4buffermedium(pH7．3)，theelectrostaticinteractionoffolicacidwithcarbonquantumdotsresultsinthefluorescencequenchingofcarbonquantumdotscharacterizedat384nm．Experimentsshowedthatthequenchedfluorescenceintensitywasinproportionaltotheconcentrationoffolicacidcontentovertherangeof0．025-2．0p~mol／Lwithacorrelationcoeficientof0．9947．Therefore，asensitivefluorescencespectrophotometricmethodforthedeterminationoffolicacidwasdeveloped．Thelimitofdetection(LOD)was2．5nmol／L．Inthiswork，thefluorescencespectra，UV—Visspectraandfluorescencelifetimewerecharacterized．Thereactionmechanismandtheoptimumofreactionconditionwerealsoinvestigated．Themethodhasbeenappliedforthedeterminationoffolicacidinsimulatedserumwiththerecoveryfrom97．3％to101．6％andtheRSDlowerthan4．9％．KeywordsFluorescencespectrophotometry；Folicacid；Carbonquantumdots(Received23August2013；accepted27December2013)ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChinafNo．21377103)'