变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用

生态学杂志ChineseJournalofEcology2006,25(10):1257～12643变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用1,231,4233单国彬金文标林佶侃邢新会(123东莞宝丽美化工有限公司,东莞523581;清华大学化学工程系生物化工研究所,北京100084;哈尔滨工业大学4深圳研究生院城市与土木工程学院,深圳518055;金迪生物科技集团,东莞523581)摘要PCR2变性梯度凝胶电泳(PCR2DGGE)具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境生态学中微生物群落多样性、动态性分析和功能细菌的跟踪。本文综述了PCR2DGGE技术的基本原理,不同DNA提取方法的比较,不同PCR方式的比较及其在环境生态学中研究微生物群落多样性、环境中微生物群落变化的动态监测、硝化菌2反硝化菌和硫酸还原菌(SRB)的动态分析和监测等领域中的应用,并对该技术自身存在的局限性和应用前景进行了评价。关键词PCR2变性梯度凝胶电泳(PCR2DGGE),废水生物处理,微生物群落,活性污泥,生物膜,硝化菌2反硝化菌,硫酸还原菌中图分类号Q938文献标识码A文章编号1000-4890(2006)10-1257-08ApplicationofPCR2denaturinggradientgelelectrophoresis(PCR2DGGE)inenvironmentalmicrobialecolo21,231,42(1gy.SHANGuobin,JINWenbiao,LINJikan,XINGXinhuiBaolimeiChemicalEngineeringCom22panyLimited,Dongguan523581,China;InstituteofBiochemicalEngineering,DepartmentofChemical3Engineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China;CollegeofUrbanandCivilEngineering,4ShenzhenGraduateSchoolofHarbinInstituteofTechnology,Shenzhen518055,China;Bio2TreatTech2nologyCompanyLimited,Dongguan523581,China).ChineseJournalofEcology,2006,25(10):1257～1264.PCR2denaturinggradientgelelectrophoresis(PCR2DGGE)hastheadvantagesofhighreliability,goodrepeti2tionandeasyoperation,andbeenwidelyusedinenvironmentalecologytoanalyzethediversityanddynamicsofmicrobialcommunities,andtomonitorfunctionalbacteria.Thispaperintroducedtheprinciplesandmeth2odsofPCR2DGGE,revieweditsapplicationinenvironmentalecologicalstudy,andanalyzeditspotentialap2plicationprospectsandlimitations.KeywordsPCR2DGGE,wastewaterbio2treatment,microbialcommunity,activatedsludge,biofilm,nitri2fying2denitrifyingbacteria,sulfate2reducingbacteria.[62]程度对微生物菌群进行鉴定。通过对分子序列1引言的分析,可以不经过培养而直接分析微生物菌群的了解特定环境下微生物群落的种群分布、遗传组成和动态变化,并探讨其亲缘关系。该技术可以多样性及其动态特征,认识细菌群落的稳定性和功克服传统方法无法清楚分类及菌群无法培养的缺能菌的作用是十分必要的。传统的方法是利用微生点。其中,PCR2DGGE(变性梯度凝胶电泳)分子生物形态、培养特性、生理生化特性、生态特性及遗传物技术是目前可以探知最为完整的环境微生物菌群特性等作为依据对微生物进行鉴定和分类。其工作结构的分子生物学技术。该技术是1979年由Fis2繁复、分析速度慢,制约因素多。并且,仅有1%的cher等[20]最先提出的用于检测DNA突变的一种电环境微生物可通过传统的培养方法在培养皿上进行泳技术。1993年Muyzer等[37]首次将DGGE用于培养和分离,尚有85%～99%细菌种群不能被分离微生物生态学研究,更加完整和准确地描述了微生[59]和认识,无法直接进行单独菌株的生理生化特性物种群多样性、数量比例和系统进化等。它的分辨测试。其原因有:1)不同的微生物之间是相互作用、精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可相互依赖的;2)自然环境中大多数细菌的真实生长以检测到一个核苷酸水平的差异。本文综述了条件很难弄清楚。因此,通过传统的微生物技术来3国家自然科学基金重点资助项目(20336010)。了解生态系统中微生物的多样性是困难的。33通讯作者分子生物学技术是利用微生物遗传物质的相似收稿日期:2006-01-20接受日期:2006-06-01\n1258生态学杂志第25卷第10期PCR2DGGE技术的基本原理和过程及其在环境生取首先需要对样品进行解絮凝和破碎细胞,然后萃态学中研究微生物群落多样性、微生物群落动态变取总DNA,最后纯化DNA。解絮凝和破碎细胞常化等领域中的应用,为快速和准确地分析微生物菌用的方法有Bead2beating法、冷冻2解冻法、酶法、化群组成、动态变化及特种菌的跟踪等提供了一个非学法(表面活性剂或碱)、超声破碎、液氮下研磨、常有效的分子生物学技术。KIT或者它们的组合等。Bead2beating法,即微生物细胞在苯酚或SDS萃取液中用玻璃珠将细胞打2PCR2DGGE的原理与方法碎、破壁,该法最大的缺点是含有大量的腐殖酸,且211基本原理DNA会被剪断。酶法,即微生物细胞分散在热SDSPCR2DGGE是利用尿素及甲酰胺2种变性物溶液中,然后采用溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E等质制成一种由低至高浓度的变性梯度电泳胶,由于进行处理。化学法是采用化学试剂使微生物细胞裂变性物质的作用,胶体上进行电泳的双股DNA序解,其混合液由多种表面活性剂、NaCl及各种缓冲[24]列会产生部分变性,形成部分单链(partialsingle液组成。Heuer等比较了这些不同的细胞破碎strand)。随着每一个DNA样品核酸序列的不同,方法的功效和重复性及对DNA萃取效率的影响。部分变性解离的程度也不相同,因此其在电泳胶中在解絮凝和细胞破碎之后,进行DNA萃取和的移动速度也有所不同(双股快、单股慢),使得部分纯化。将复杂的细胞分子混合物加入有机溶媒,除变性的DNA会在相同时间内,在胶体上跑出不同去蛋白质及其它成分,从而纯化DNA。利用酚及氯的距离。而DNA变性的程度则与其解链温度仿可使蛋白质变性(denaturation)的特性来进行萃(meltingpoint,Tm)有关,不同序列的DNA会有不取的步骤,DNA和RNA不溶于有机溶媒中,而溶于同的Tm,低Tm的DNA会在低浓度的变性物质作水层。另外,常利用琼脂凝胶来分离不同大小的用下产生变性形成部分单链,而高Tm的DNA则必DNA片段或用以纯化DNA。目前从活性污泥中提[26,58][35]须在高浓度的变性物质作用下才会产生变性。因取DNA的报道很多。Miller等比较了不此,利用DGGE可以将大小相同、序列组成不同的同表面活性剂(SDS、Chelex100、异硫氰酸胍)、不同DNA鉴别开来。物理破碎方式(微珠机械研磨、冷冻2解冻裂解)和酶212PCR2DGGE流程消化等对DNA的提取率和分子量大小的影响。结PCR2DGGE的基本流程是,首先从环境中取得果表明,用SDS结合氯仿或苯酚进行玻璃珠研磨可样本,如地下水、活性污泥、生物膜等,进行微生物总以优化DNA提取量及分子量。在SDS处理前进行DNA的提取;然后通过聚合酶连锁反应(PCR)将提溶菌酶消化或者异硫氰酸胍处理或者加入Chelex取的总DNA中的特定序列进行扩增,其扩增产物100树脂都不能提高DNA产量。在一个含有氯仿、利用DGGE进行分离;最后,对DGGE带进行测序SDS、NaCl和磷酸2Tris(pH8)缓冲液的混合裂解液并鉴定分析或者被印渍在尼龙膜上与标记的寡核苷中采用玻璃珠机械研磨是最好的物理破碎方式。低酸专一性探针进行杂交,鉴定群落成员。速率、短时间(30～120s)是玻璃珠机械研磨的最佳在PCR2DGGE分子生物技术中,样品总DNA条件。比较了4种DNA纯化方式(硅胶键合DNA、的提取和纯化是前提,引物设计及其PCR方式是关凝胶电泳、醋酸铵沉淀和交联葡聚糖G2200凝胶过键。为了更好的显示DGGE条带,可以选择不同的滤),表明交联葡聚糖G2200柱纯化是最好的纯化办[49][33][42][52]染色方式(EB、SYBRGreenI和银染)。其中,法。Leff等比较了Ogram法、Tsai法和[27]SYBRGreenI染色的优点是背景色低,可以观察到Jacobsen法3种方法。其中,Jacobsen法提取的尽可能多的条带;银染的灵敏度最高,但银染过后的DNA产量最低,但是纯度最高;Ogram法提取的时[26]条带不能用于杂交分析。间最长,DNA产量最高,但是纯度一般;Tsai法提取213总DNA提取的时间最短,其产量中等,但是纯度最低。沉淀物、活性污泥和生物膜等样品中细菌种类萃取效率、DNA的分子量大小和纯度是DNA[39]复杂且混杂有大量有毒物质,如何使所有细胞裂解、萃取的关键指标。Niemi等证明了DNA分离和充分释放DNA、有效去除杂质,建立高效、可靠的纯化过程影响样品中微生物菌群的结构。很多研究DNA提取方法成为研究者关注的热点。总DNA提人员采用改良方法来提高DNA的提取率和纯度。\n单国彬等:变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用1259[43][37][12]比如,Purohit等报道了在核酸预萃取之前,用落和生物膜的群落复杂性分析。Curtis等采-1pH为910的50mmol·LTris2HCl进行洗涤。采用PCR2DGGE比较了不同污水处理厂的活性污泥[23]用0101%吐温220在50℃下进行预处理,然后用中总微生物群落的多样性。Gillan等采用PCR2有机溶剂丙酮和石油醚萃取杂质可以提高DNA纯DGGE并结合序列克隆分析了双壳类生物的壳上[2]度。此外,升温(60℃～沸腾)、加入苯酚或氯仿或生物膜中微生物群落组成。陈红歌等采用PCR2加入螯合剂(EDTA和Chelex100)等措施也能提高DGGE研究了垃圾填埋场细菌种群空间分布及组成[3]DNA提取效率。多样性。殷峻等应用PCR2DGGE技术研究处理214PCR扩增含氨废气的生物滤塔中微生物多样性及处理时间对PCR扩增是PCR2DGGE技术中至关重要的步生物多样性的影响。[54]骤。通常采用16SrDNA中的保守区作为引物进行Ward等采用PCR2DGGE研究了温泉中微[10,41][1]PCR反应。这是由于16SrDNA具有以下几生物群落的动态变化。刘新春等采用PCR2个特点:1)16SrDNA约为1500个核苷酸长,序列DGGE法解析了活性污泥系统中微生物群落结构变长短适中,适合用作分类学上的研究;2)任何一种原化,比较了常温条件下运行的2个不同的活性污泥核生物体都具有16SrDNA;3)16SrDNA非常保系统中微生物群落结构的动态变化。由于工艺相守;4)16SrDNA不会在不同的个体间进行基因交同,使得接种的低温群落和常温群落在相同的操作[4]换,各物种具自己的独特序列;5)目前已有相当完备条件下,产生相似的微生物群落结构。滕应等用的16SrDNA基因资料库,经过GenBank和Riboso2PCR2DGGE分析了重金属污染的农田土壤中微生malDatabaseProject(RDP)基因资料库作对比分物多样性及群落动态的变化。电泳图谱表明,PCR[59]析,并可进行亲源关系分析、鉴定等。Yu等研究产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离了16SrDNA不同可变区V1、V3、V5、V6、V8及V1效果好,可明显反映出重金属复合污染导致了农田～V3、V3～V5、V6～V8区的PCR扩增产物及其土壤微生物在基因上的损伤,影响到农田土壤生态DGGE结果。结果表明扩增V3区及V3～V5区的系统的细菌丰富度,改变了土壤环境的优势群落,从引物为最佳引物选择。V3区的PCR2DGGE条带数而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。最多、分离效果最好。如果需要较长的扩增产物,则16SrRNAPCR2DGGE已经被应用于热泉中藻[22]选择V3～V5区。青菌群在不同温度下的分布。不同温度下,相同为了提高DGGE的检测敏感性,通常在一侧引位置或者不同位置其DGGE条带分析是不同的,这物的5’端设计增加一段富含GC的区域(GC2说明在不同温度下,具有不同的微生物群落。Clamp,GC钳,其长度通常为30～50个核苷DGGE条带的序列分析表明除了一些已知的微生物[25][40]酸),避免了DNA的完全解链,从而提高了不同种类,还存在一些新的细菌种类。Nübel等设计碱基的检出率;或者对传统的PCR模式进行改良以了从藻青菌中提取的16SrDNA的专一性扩增的引提高DGGE的灵敏度,巢式PCR(NestedPCR)就是物对,并利用DGGE比较青苔、海水等样品中藻青应用最广泛的一种,它由两轮PCR扩增和利用两套菌种类的多样性。[36]引物对所组成。首先对靶DNA进行第1步扩增,1996年,Murray等采用PCR2DGGE比较2[62]然后从第1次反应产物中取出少量作为反应模板进个江口的浮游细菌的系统多样性。Zwart等通行第2次扩增,第2次PCR引物与第1次反应产物过巢式PCR2DGGE分析了荷兰温水湖中Verru2的序列互补,第2次PCR扩增产物即为目的产物。comicrobiales的多样性,并且证实湖中全年都存在这些菌。3PCR2DGGE在环境生态学中的应用[24]Heuer等采用PCR2DGGE研究了不同土壤311微生物多样性中放线菌类的遗传多样性,并检测马铃薯根际的放由于不需要了解单菌特征,PCR2DGGE已被广线菌种类变化。这项研究中,使用了两套PCR策泛用于废水生物处理过程中总体细菌种群或者具体略,一是使用种属特异性引物的放线菌16SrDNA细菌种群的遗传多样性分析。1993年,基于16S直接扩增;二是间接扩增,用前面使用的种属特异性rDNA片段的PCR2DGGE首先被应用于微生物群引物和一反向细菌引物获得的放线菌专一性DNA\n1260生态学杂志第25卷第10期片段;然后,用两类引物进行巢式PCR。直接PCR2脱氮效率。其中,AOB菌参与的氧化反应是硝化反DGGE可以快速了解放线菌的系统多样性,巢式应的限速步骤,AOB在自然环境中数量小、生长速PCR2DGGE可以估计土壤中放线菌数量所占全部率慢并且生物量低,因此很难通过传统的纯培养筛[29]细菌的比例。选分离。然而,PCR2DGGE技术可以对自然环312微生物群落的动态变化境中AOB的分类和分布提供更完整的信息。[9]PCR2DGGE的最大优势之一是可以同时分析Cébron等采用PCR2DGGE研究了从巴黎马恩河多个样品,是检测环境变化后引起微生物群落变化(MarneRiver)出口到翁弗勒尔(Honfleur)河口的一[17]的一个强有力的工具。Donner等跟踪了远洋的段长为365km的富含氨的塞纳河(SeineRiver)的动态变化过程中细菌群落结构和活性的连续变化。AOB群落。DGGE结果表明AOB主要有两大群从不同时间、不同地点的水样提取的细菌总DNA落:一类是β2Proteobacteria纲中的Nitrosomonas和的16SrDNAPCR2DGGE条带变化反映纤维素酶Nitrosospira;另一类是γ2Proteobacteria纲中的Ni2[46]和酯酶的酶活性的变化。Santegoeds等结合微trosococcusoceani和N.halophilus。不同的AOB菌传感器和PCR2DGGE技术监测了生长的细菌生物属和菌系之间的生理和生态学特征是不同的。AOB膜中群落的变化、硫酸还原菌的开始、缺氧区的变群落分布会受进水特性、时间、空间、盐度、pH、氨浓化。DGGE结果显示:伴随着生物膜的生长,观察到度和固体腰浮颗粒等因素影响。来自于进水中的DGGE条带数增多,表明细菌种类的增多。Fer2AOB可以保持它们的生物量甚至生长,有利于江河[19][44]ris等采用DGGE研究了热泉微生物膜中温度梯中氨污染的解决。Rowan等采用PCR2DGGE研度变化时微生物群落的分布变化。DGGE条带分析究了水处理反应器中AOB群落的组成和多样性。[5]表明相同温度的同一位置和不同位置的样品具有相Avrahami等研究了温度对AOB菌种群结构的直[6]似的DGGE条带,但是不同温度时具有不同的条接或间接影响。Bollmann等研究了饥饿对AOB[48]带。的影响。Silyn2Roberts等利用DGGE在线分析313富集和筛选过程中菌株的分析和跟踪了生物膜中的硝化菌Nitrosomonasspp.。PCR2DGGE除了可以研究微生物群落的复杂巢式PCR2DGGE技术对总群落中氨氧化菌的[9]性,还可以监测富集培养过程中的微生物。1996检出率可以达到0101%。Cébron等采用巢式[47]年,Santegoeds等使用PCR2DGGE监测热泉藻PCR2DGGE研究了塞纳河下游中硝化菌和AOB的青群落中好氧化能有机营养细菌的富集培养。典型特征及其遗传多样性、时间稳定性等。在相似[18]Felske等采用PCR2DGGE跟踪了分离的细菌样的水利条件(停留时间)、气候条件(温度)、营养条件[51](NH+品在丰富培养基上的培养效率等。Teske等使4浓度)以及细菌的进水条件,会导致环境中用rDNA片段DGGE跟踪混合培养和纯培养过程AOB细菌具有同样的选择性和适应能力。环境因中细菌菌株的筛选分离过程,并分离得到2个菌株,素的变化会导致AOB细菌空间上的变化,但细菌种[7]Desulfovibrio和Arcobacter。Brinkhoff等采用特类随时间的变化很小。通过序列分析表明大多数条定的16SrDNA的PCR2DGGE结合微生物学技术带均隶属于β2Proteobacteria亚纲的AOB菌。其中,从环境中分离出7株新的硫酸氧化菌Thiomi2有些细菌与Aquaspirillumserpens具有98%的同crospira,而无需通过选择性培养和富集培养来筛选源性,与Methylophilusleisingeri具有94%的同源分离。然后,采用专一性Thiomicrospira探针对性,与Dechloromonassp.具有97%的同源性。还有PCR2DGGE带进行基因杂交检测和跟踪目标位置一些具有代表性的N.oligotropha和N.ureae细[28]的Thiomicrospira。Jaspers等使用PCR2DGGE菌。此外,还发现一些嗜盐和耐盐的新的AOB菌。[21]结合等点聚焦的方法分离并跟踪不同细菌。Freitag等采用PCR2DGGE研究了苏格兰天314氨化菌、硝化菌及反硝化菌的分析与跟踪然海边沉积物中微生物群落的结构和变化。DGGE生物脱氮过程中有氨化细菌(ammonia2oxidiz2条带表明缺氧沉积物中β2Proteobacterial的AOB菌ingbacteria,AOB)、亚硝酸菌(Nitrosomonas)、硝酸的复杂性和多样性,并发现新的优势群落Ni2菌(Nitrobacter)和反硝化菌的参与。这些菌的种类trosospira能够进行无氧氨氧化。但未发现厌氧脱十分丰富,其群落结构和动态变化会影响微生物的氮菌的相关序列。\n单国彬等:变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用1261[30]Kowalchuk等采用PCR2DGGE鉴定和分析的多样性。用DGGE分析和比较了不同深度的海滩沙丘中β2ProteobacterialAOB菌。采用简并PCR产物和核酸RT2PCR产物,只有两类活性微生PCR引物CTO189f2GC和CTO654r扩增了V22物菌株存在,并且占的比例很低。采用Desulfone2和V23可变区的长度为4652bp的16SrDNA片段,ma的专一性寡核苷酸探针对16SrDNA片段的并通过DGGE分析了不同pH和离海岸不同距离的DGGE条带进行杂交分析,确定了Desulfonema菌土壤样品中β2亚门ProteobacteriaAOB菌的多样性。的分布情况。[45]在7种已知的β2亚门AOB菌中检测到了6种,并且Santegoeds等用16SrDNADGGE研究了来不同位置的样品中具有不同的微生物群落结构,这自污水处理厂的生物膜中SRB种群的变化和硫酸些不同反映了β2亚门AOB菌生理学上的不同。还原的优化。在生物膜的生长过程中,微生物群落DGGE的对比分析表明,在沙丘中存在与海里相似的遗传多样性增多。用专一性寡核苷酸探针对的Nitrosomonas,Nitrosospira菌类在所有的样品中DGGE条带进行杂交分析,在所有的生物膜和活性都能够检测到,但是不同pH值的沙土里Ni2污泥样品中,Desulfobulbus和Desulfovibrio是主要trosospira的序列类型是不同的,只有一个样品中可的SRB,在好氧层内部的厌氧区存在一种隶属于检测到Nitrosomonas种。Desulfonema的丝状SRB。但是,在第6周和第8传统的硝化2反硝化过程很难进行有效的生物周,可以发现不同种类的Desulfobulbus和Desul2+除氮,特别是低COD、高NH42N的污水。OLANDfovibrio。[61](oxygenlimitedautotrophicnitrification&denitrifi2Zhang等采用PCR2DGGE研究了海边腐蚀cation)是一个新的组合系统,是基于氨到亚硝酸盐性生物膜中微生物的系统多样性,112个克隆中,52的部分硝化,结合厌氧条件下氨的氧化。这个系统个克隆(4614%)隶属于2个SRB家族:Desulfovib2+能够高效的处理低COD、高NH42N污水,不需要rionaceae和Desulfobacteriaceae。另外,44个克隆+额外的碳源加入并且没有任何污泥产生,比传统的(3913%)属于低G+C的Clostridiaceae家族的G系统使用更少的能源和氧气。这个系统,关键是通菌。其中3个克隆(217%)是Chlorobiumvibrio2过控制氧的供给实现稳定的部分硝化(亚硝酸盐的forme,一株绿硫菌。[57][13]积累)。OLAND系统的部分硝化步骤是指氨到Dar等采用3步巢式PCR2DGGE技术跟踪亚硝酸盐的氧化,亚硝酸盐到硝酸盐的进一步氧化监测工业生物反应器中复杂微生物群落中的SRB。可以通过氧传输的控制。硝化反应主要是自养的第1步采用细菌通用引物对几乎完整的16SrRNAAOB菌,比如Nitosomonas、Nitrosospira和Nitroso2进行PCR扩增;随后,该PCR产物被用作模板采用[60]coccus菌属。Zhang等采用巢式PCR研究了专一性SRB引物进行第2次PCR扩增;第3次OLAND系统中氧控制的亚硝化步骤中AOB菌的PCR反应选用特定的引物,其相应的PCR产物用数量和群落结构组成的变化。结果表明,当溶氧逐于DGGE分析和观察。采用Desulfovibrio2Desul2渐降低时,AOB菌的群落组成会发生剧烈变化;稳fomicrobium的特定引物的PCR2DGGE条带数量定的亚硝酸盐累积阶段的主要AOB菌完全不同于多,表明了SRB的种类多样性。此外,还检测到其氧控制的亚硝化早期步骤的AOB菌。在氧控制的它的SRB群落,如Desulfotomaculum、Desulfobul2亚硝化步骤的主要AOB菌是Nitrosomonas;在稳定bus和Desulfococcus2Desulfonema2Desulfosarcina的亚硝酸盐累积阶段中,Nitrosomonas约占AOB菌等。没有检测到Desulfobacterium和Desulfobac2的7215%±018%。在氧限速硝化步骤,随着DOter。值的降低,AOB菌的变化非常明显。4优势和缺陷315硫酸还原菌(Sulfate2reducingbacteria,SRB)的分析与跟踪DGGE技术具有以下优点:1)分辨率高。能够DGGE被用于跟踪微生物群落中SRB的群落检测出只存在单碱基差异的突变个体。2)加样量[50]结构及其随时间、空间的动态变化。Teske等采小。1～5ng的DNA或RNA加样量就可达到清晰用PCR2DGGE分析丹麦的玛丽艾厄(Mariager)海的电泳分离效果。3)重复性好。电泳条件如温度、域的分层河床中SRB的活性和种类,证实了SRB时间等易于控制,可保证电泳的重现性和结果的重\n1262生态学杂志第25卷第10期复性。4)节约时间。电泳可在30min至1h内完酶。可利用已发现的功能基因,如氨单加氧酶[16][38]成。5)操作简便、快速,可以同时检测多个样品。(AMO)基因、亚硫酸还原酶基因等,进行BIO2RAD公司的Dcode普通突变检测系统可在2hPCR2DGGE分析微生物群落的功能菌的变化。此内检测64个样品。外,DGGE的发展可以促进分析微生物群落复杂性DGGE技术具有以下缺陷:1)其检测的DNA的其它基因指纹技术的发展。比如,16SrRNA片段最适长度为200～900bp,超出此范围的片段难PCR2SSCP(single2strandconformationpolymor2[15]以检测;2)PCR扩增所需G2C碱基对含量至少达phism)技术被用于研究天然细菌群落的多样性。40;3)如果电泳的条件不适宜,不能保证可以将有一ARDRA(amplifiedribosomalDNArestrictionanaly2[32]定序列差异的DNA片段完全分开,会出现序列不sis)也被用于分析混合微生物群落的基因多样[31]同的DNA迁移在同一位置的现象。DGGE的条带性。Kowalchuk等证明了RNADGGE分析方法数不能正确反映被分析的混合物中不同序列的数也是一种检测微生物群落变化的快速方法,它可检量。有时一条DGGE带可能代表几种菌,或者可能测分析DNADGGE技术很难检测到的活性群落。不同的几条DGGE带代表同一种细菌。实际上,混参考文献合物中细菌DNA数量较少的细菌DNA可能得不到PCR扩增。Vallaeys等[53]发现尽管不同的甲烷[1]刘新春,吴成强,张昱,等.2005.PCR2DGGE法用于活性污泥系统中微生物群落结构变化的解析[J].生态学报,25氧化菌有实质的序列差异,但其16SrDNA片段不(4):842～847.能通过DGGE进行分离。Buchholz2Cleven等[8]发[2]陈红歌,胡元森,贾新成,等.2005.垃圾填埋场细菌种群空间分布及组成多样性研究[J].环境科学学报,25(6):809～现DGGE很难分离的只有2～3个核苷酸不同的815.rDNA片段。此外,在总DNA提取过程中,如何评[3]殷峻,陈英旭,刘和,等.2004.应用PCR2DGGE技术研究处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性[J].环境科价细胞裂解和DNA的回收效率、提取的DNA能否学,25(6):12～16.代表微生物菌群中的优势菌群等都是研究的难点。[4]滕应,骆永明,赵祥伟,等.2004.重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR2DGGE分析[J].土壤学报,41(3):343～347.5发展前景[5]AvrahamiS,LiesackW,ConradR.2003.Effectsoftempera2tureandfertilizeronactivityandcommunitystructureofsoilam2尽管PCR2DGGE存在着一些缺陷,但它具备的moniaoxidizers[J].Environ.Microbiol.,5:691～705.[6]BollmannA,SchmidtI,SaundersAM,etal.2005.Influence显著优点不仅使得人们对复杂微生态系统的解析成ofstarvationonpotentialammonia2oxidizingactivityandamoA为可能,也使得对微生物群落动态变化的研究成为mRNAlevelsofNitrosospirabriensis[J].Appl.Environ.Microbiol.,71:1276～1282.可能,是一种非常适合分析废水生物处理过程中微[7]BrinkhoffT,MuyzerG.1997.Increasedspeciesdiversityand生物群落的多样性及动态变化的基因指纹技术。这extendedhabitatrangeofsulfuroxidizingThiomicrospiraspp[J].Appl.Environ.Microbiol.,63:3789～3796.也是PCR2DGGE深受人们关注的最重要的原因。[8]Buchholz2ClevenBEE,RattundeB,StraubKL.1997.Screen2自Muyzer等[37]开辟了PCR2DGGE在微生物生态ingforgeneticdiversityofisolatesofanaerobicFe(Ⅱ)2oxidizingbacteriausingDGGEandwholecellhybridization[J].Syst.领域研究的先河以来,该技术迅速引起微生物生态Appl.Microbiol.,20:301～309.学家的关注,现已发展成为环境微生物群落结构分[9]CébronA,CociM,GarnierJ,etal.2004.Denaturinggradi2entgelelectrophoreticanalysisofammonia2oxidizingbacterial析研究的主要手段之一。在微生物分子生态学领communitystructureinthelowerSeineRiver:ImpactofParis域,一个令人兴奋的新方向是利用功能基因作为分wastewatereffluents[J].Appl.Environ.Microbiol.,70:6726～6737.[11,14,34]子标记物研究代谢活性。最近,人们在生物[10]ChouariR,LePaslierD,DaugaC,etal.2005.Novelmajor反应器中应用PCR2DGGE技术检测不同Desul2bacterialcandidatedivisionwithinamunicipalanaerobicsludgedigester[J].Appl.Environ.Microbiol.,71:2145～2153.[55]fovibrio群落中[NiFe]氢化酶的不同表达。[11]CoolenMJ,PostE,DavisCC,etal.2005.CharacterizationofWawer等[56]首次使用DGGE分析了Desulfovibriomicrobialcommunitiesfoundinthehumanvaginabyanalysisofterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismsof16SrRNA菌株中[NiFe]氢化酶基因以及不同生物膜中genes[J].Appl.Environ.Microbiol.,71:8729～8737.[12]CurtisTP,CraineNG.1998.ThecomparisonofthediversityDesulfovibrio菌的系统多样性。通过对总DNA和ofactivatedsludgeplants[J].WaterSci.Technol.,37:71～mRNA的PCR产物的DGGE条带进行分析比较,78.[13]DarSA,KuenenJG,MuyzerG.2005.NestedPCR2denaturing至少发现有两类Desulfovibrio菌,但是只有其中的gradientgelelectrophoresisapproachtodeterminethediversity一类Desulfovibrio菌可以优势的表达[NiFe]氢化ofsulfate2reducingbacteriaincomplexmicrobialcommunities\n单国彬等:变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用1263[J].Appl.Environ.Microbiol.,71:2325～2330.Microbiol.,71:197～206.[14]DeGelderL,VandecasteeleFPJ,BrownCJ,etal.2005.Plas2[30]KowalchukGA,NaoumenkoZS,DerikxPJL,etal.1999.middonoraffectshostrangeofpromiscuousIncP21βplasmidpBMolecularanalysisofammonia2oxidizingbacteriaoftheβ2subdi210inanactivated2sludgemicrobialcommunity[J].Appl.visionoftheclassProteobacteriaincompostandcompostedma2Environ.Microbiol.,71:5309～5317.terials[J].Appl.Environ.Microbiol.,65:396～403.[15]DohrmannAB,TebbeCC.2005.Effectofelevatedtropospherico2[31]KowalchukGA,StephenJ,DeBoerW,etal.1997.Analysiszoneonthestructureofbacterialcommunitiesinhabitingtherhizo2ofammonia2oxidizingbacteriaoftheβ2subdivisionoftheclasssphereofherbaceousplantsnativetoGermany[J].Appl.Environ.proteobacteriaincoastalsanddunesbydenaturinggradientgelMicrobiol.,71:7750～7758.electrophoresisandsequencingofPCR2amplified16Sribosomal[16]DollhopfSL,HyunJH,SmithAC,etal.2005.QuantificationDNAfragments[J].Appl.Environ.Microbiol.,63:1489～ofammonia2oxidizingbacteriaandfactorscontrollingnitrification1497.insaltmarshsediments[J].Appl.Environ.Microbiol.,71:[32]LagacéL,PitreLM,JacquesM,etal.2004.Identificationof240～246.thebacterialcommunityofmaplesapbyusingamplifiedriboso2[17]DonnerG,SchwarzK,HoppeHG,etal.1996.ProfilingthemalDNA(rDNA)restrictionanalysisandrDNAsequencing[J].successionofbacterialpopulationsinpelagicchemoclines[J].Appl.Environ.Microbiol.,70:2052～2060.Arch.Hydrobiol.(Spec.IssuesAdv.Limnol.),48:7～14.[33]LeffLG,DanaJR,McArthurJV,etal.1995.Comparisonof[18]FelskeA,RheimsH,WolterinkA,etal.Ribosomeanalysisre2methodsofDNAextractionfromstreamsediments[J].Appl.vealsprominentactivityofanunculturedmemberoftheclassEnviron.Microbiol.,61:1141～1143.Actinobacteriaingrasslandsoils[J].Microbiology,143:2983[34]McCammonMT,GilletteJS,ThomasDP,etal.2005.Detec2～2989.tionbydenaturinggradientgelelectrophoresisofpncAmutations[19]FerrisMJ,WardDM.1997.SeasonaldistributionsofdominantassociatedwithpyrazinamideresistanceinMycobacteriumtuber216SrRNAdefinedpopulationsinahotspringmicrobialmatex2culosisisolatesfromtheUnitedStates2Mexicoborderregion[J].aminedbydenaturinggradientgelelectrophoresis[J].Appl.Antimicrob.AgentsChemother.,49:2210～2217.Environ.Microbiol.,63:1375～1381.[35]MillerDN,BryantJE,MadsenEL,etal.1999.Evaluation[20]FischerSG,LermanLS.1979.Length2independentseparationandoptimizationofDNAextractionandpurificationproceduresofDNArestrictionfragmentsintwo2dimensionalgelelec2forsoilandsedimentsamples[J].Appl.Environ.Microbiol.,trophoresis[J].Cell,16:191～200.65:4715～4724.[21]FreitagTE,ProsserJI.2003.Communitystructureofammonia[36]MurrayAE,HollibaughJT,OrregoC.1996.Phylogeneticcompo2oxidizingbacteriawithinanoxicmarinesediments[J].Appl.sitionsofbacterioplanktonfromtwoCaliforniaestuariescomparedbyEnviron.Microbiol.,69:1359～1371.denaturinggradientelectrophoresisof16SrDNAfragments[J].[22]GichF,SchubertK,BrunsA,etal.2005.Specificdetection,Appl.Environ.Microbiol.,62:2676～2680.isolation,andcharacterizationofselected,previouslyuncultured[37]MuyzerG,WaalEC,UitterlindenAG.1993.Profilingofcom2membersofthefreshwaterbacterioplanktoncommunity[J].plexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgelelec2Appl.Environ.Microbiol.,71:5908～5919.trophoresisanalysisofpolymerasechainreaction2amplifiedgenes[23]GillanDC,SpeksnijderAGCL,ZwartG,etal.1998.Geneticcodingfor16SrRNA[J].Appl.Environ.Microbiol.,59:diversityofthebiofilmcoveringMontacutaferruginosa(Mol2695～700.lusca,Bivalvia)asevaluatedbydenaturinggradientgelelec2[38]NakagawaT,IshibashiJI,MaruyamaA,etal.2004.AnalysistrophoresisanalysisandcloningofPCR2amplifiedgenefragmentsofdissimilatorysulfitereductaseand16SrRNAgenefragmentscodingfor16SrRNA[J].Appl.Environ.Microbiol.,64:fromdeep2seahydrothermalsitesoftheSuiyoseamount,Izu23436～3472.BoninArc,WesternPacific[J].Appl.Environ.Microbiol.,[24]HeuerH,SmallaK.1997.Applicationofdenaturinggradient70:393～403.gelelectrophoresis(DGGE)andtemperaturegradientgelelec2[39]NiemiRM,HeiskanenI,WalleniusK,etal.2001.Extractiontrophoresis(TGGE)forstudyingsoilmicrobialcommunitiesandpurificationofDNAinrhizospheresoilsamplesforPCR2[A].In:vanElsasJD,TrevorsJT,WellingtonEMH,eds.DGGEanalysisofbacterialconsortia[J].J.Microbiol.ModernSoilMicrobiology[C].NewYork:MarcelDekker,Method,45:155～165.Inc.,353～373.[40]NübelU,Garcia2PichelF,MuyzerG.1997.PCRprimersto[25]HolbenWE,FerisKP,KettunenA,etal.2004.GCfraction2amplify16SrRNAgenesfromCyanobacteria[J].Appl.ationenhancesmicrobialcommunitydiversityassessmentandde2Environ.Microbiol.,53:3327～3332.tectionofminoritypopulationsofbacteriabydenaturinggradient[41]O’DonnellAG,GÊrresHE.1999.16SrDNAmethodsinsoilgelelectrophoresis[J].Appl.Environ.Microbiol.,70:2263microbiology[J].Curr.Opin.Biotechnol.,10:225～229.～2270.[42]OgramA,SaylerGS,BarkayT.1987.Theextractionandpu2[26]IbrahimA,AhringBK.1999.ExtractionofintactribosomalrificationofmicrobialDNAfromsediments[J].J.Microbiol.RNAfromanaerobicbioreactorsamplesformolecularecologicalMethod,7:57～66.studies[J].Biotechniques,27:1132～1138.[43]PurohitHJ,KapleyA,MoharikarAA,etal.2003.Anovel[27]JacobsenCS,RasmussenFO.1992.Developmentandapplica2approachforextractionofPCR2compatibleDNAfromactivatedtionofanewmethodtoextractbacterialDNAfromsoilbasedonsludgesamplescollectedfromdifferentbiologicaleffluenttreat2separationofbacteriafromsoilwithcation2exchangeresin[J].mentplants[J].J.Microbiol.Method,52:315～323.Appl.Environ.Microbiol.,58:2458～2462.[44]RowanAK,SnapeJR,FearnsideD,etal.2003.Composition[28]JaspersE,OvermannJ.1997.Separationofbacterialcellsbyanddiversityofammonia2oxidisingbacterialcommunitiesinisoelectricfocusing,anewmethodforanalysisofcomplexmicro2wastewatertreatmentreactorsofdifferentdesigntreatingidenti2bialcommunities[J].Appl.Environ.Microbiol.,63:3176calwastewater[J].FEMSMicrobiol.Ecol.,43:195～206.～3181.[45]SantegoedsC,FerdelmanTG,MuyzerG,etal.1998.Struc2[29]JordanFL,CanteraJJL,FennME,etal.2005.Autotrophicturalandfunctionaldynamicsofsulfate2reducingpopulationsinammonia2oxidizingbacteriacontributeminimallytonitrificationbacterialbiofilms[J].Appl.Environ.Microbiol.,64:3731inanitrogen2impactedforestedecosystem[J].Appl.Environ.～3739.\n1264生态学杂志第25卷第10期[46]SantegoedsCM,MuyzerG,deBeerD.1997.Successionalpro2[55]WawerC,JettenMSM,MuyzerG.1997.Geneticdiversitycessesinaba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