两种原生动物摄食生态学及其与原油降解菌的相互作用

密级：学校代码：10075分类号：学号：20071105理学硕士学位论文两种原生动物摄食生态学及其与原油降解菌的相互作用学位申请人：曹卫荣指导教师：李凤超副教授学位级别：理学硕士学科专业：水生生物学授予单位：河北大学答辩日期：二〇一〇年五月\nClassifiedIndex:Code:10075U.D.C:NO:20071105ADissertationfortheDegreeofM.ScienceThefeedingecologyoftwoprotozoaandtheinteractionwiththecrudeoildegradingbacteriaCandidate:CaoWei-rongSupervisor:AssociateProf.LiFeng-chaoAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:HydrobiologyDateofOralExamination:May2010University:HebeiUniversity\n\n\n摘要摘要原生动物物种丰富，摄食方式多样，周转迅速，是微食物环的重要成分，在水生态系统中起着重要的作用。原生动物摄食生态学研究将有助于对水生态系统结构、功能和过程深入了解。实验室条件下研究了起始食物浓度和温度对舞行波豆虫(Bodosaltans)和梨形四膜虫(Tetrahymenapriformis)种群生长的影响、细菌代谢活性对梨形四膜虫摄食率的影响、梨形四膜虫培养物对原油的降解能力，以及梨形四膜虫的摄食作用对鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)降解原油效率的影响。结果如下：6666(1)在起始食物浓度分别为2.10×10、2.80×10、4.20×10和6.40×10cell/mL的条-1件下，舞行波豆虫种群生长率分别为0.1166、0.1376、0.1202和0.1128h，相应的世代时间分别为5.90、5.00、5.80和6.10h。温度对舞行波豆虫种群生长有显著影响，当培养温度分别为10、20和30℃时，舞行波豆虫种群生长率分别为0.0500、0.1246和0.1203-1h，相应的世代时间分别为13.86、5.60和5.80h。温度从10℃升高到20℃时，舞行波豆虫的种群生长率升高到2.49倍，相应世代时间减少8.3h；而当培养温度从20℃升高到30℃时种群生长率和世代时间变化不大。与个体大小相近的其它异养鞭毛虫类群(如领鞭毛类)相比，波豆虫具有种群增长迅速，世代时间短的特点。6777(2)在起始食物浓度分别为7.50×10、1.50×10、3.00×10、和6.00×10cell/mL的条-1件下，梨形四膜虫种群生长率分别为0.0700、0.0870、0.0920和0.0830h，相应的世代时间分别为14.30、11.40、10.90和12.00h。温度对梨形四膜虫种群生长有显著影响，当培养温度分别为10、20和30℃时，梨形四膜虫种群生长率分别为0.0400、0.0800和-10.0700h，相应的世代时间分别为19.80、8.55和9.59h。温度从10℃升高到20℃时，梨形四膜虫种群的温度系数Q10为2.32。梨形四膜虫和舞行波豆虫种群对初始食物浓度和温度表现出相同的反应趋势。4-1-1(3)梨形四膜虫对活体细菌的摄食率为7.43±0.086×10bac·ciliateh，而对热杀死细4-1-1菌的摄食率为5.96±0.229×10bac·ciliateh，对活体细菌的摄食率是对热杀死细菌摄食率的1.25倍，表明梨形四膜虫优先摄食代谢活性旺盛的细菌。(4)当初始原油浓度分别为0.25%、0.5%和1%时，梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解率分别为68.08%、60.92%、37.40%，表明梨形四膜虫麦粒培养物对于原油具有很强的-I-\n摘要降解能力。(5)当向鲍氏不动杆菌原油降解体系中引入梨形四膜虫种群时，受梨形四膜虫摄食作用的影响，鲍氏不动杆菌的种群大小显著降低(P＜0.01)。但单个鲍氏不动杆菌的降解效率分别提高了5.43倍(1%)、9.05倍(0.5%)、10.40倍(0.25%)。方差分析表明，梨形四膜虫的摄食作用使单个鲍氏不动杆菌的降解效率显著提高(P＜0.01)。关键词原生动物；舞行波豆虫；梨形四膜虫；起始食物浓度；温度；种群生长；鲍氏不动杆菌；原油降解-II-\nAbstractAbstractFree-livingprotozoans,withhighspeciesrichnessanddiversefeedingstrategies,areimportantmembersofmicrobialfoodwebsandplayinganimportantroleinaquaticecosystems.Strengthenandexpendtheresearchesonprotozoanfeedingecologywillcontributetounderstandingonthestructure,functionandtheprocessofwaterecosystems.TheeffectsofinitialfoodconcentrationandculturetemperatureonthepopulationgrowthofheterotrophicflagellateBodosaltansandciliateTetrahymenapriformis,theeffectsofbacteriametabolicactivityonthefeedingrateofT.priformis,thedegradationabilityofT.priformisculture,andtheimpactofT.priformisgrazingonthecrudeoilbiodegradationofAcinetobacterbaumanniiwerestudiedunderlaboratoryconditions.Theresultsareasfollows:666(1)Whentheinitialfoodconcentrationswere2.10×10,2.80×10,4.20×10and6-16.40×10cell/mL,thepopulationgrowthrateswere0.1166,0.1376,0.1202and0.1128h,andthegenerationtimewere5.90,5.00,5.80and6.10h,respectively.CulturetemperaturealsohadsignificanteffectonthepopulationgrowthofB.saltans.Whentheculturetemperaturewere10℃,20℃and30℃,thepopulationgrowthratesofB.saltanswere0.0500,-10.1246,and0.1203h,andthegenerationtimewere13.86,5.60,and5.80h,respectively.Whenculturetemperatureincreasedfrom10℃to20℃,B.saltanshada2.49timesincreaseinpopulationgrowthrate,thecorrespondinggenerationtimereduced8.3h;andwhentheculturetemperatureincreasedfrom20℃to30℃,therewerenosignificantchangesinthemaximumpopulationgrowthrateandgenerationtime.Comparedwithotherheterotrophicflagellates(eg.Choanoflagellates)withsimilarsize,Bodowascharacterizedbyrapiderpopulationgrowthandshortergenerationtime.6777(2)Whentheinitialfoodconcentrationswere7.50×10,1.50×10,3.00×10and6.00×10-1cell/mL,thepopulationgrowthrateswere0.0700、0.0870、0.0920and0.0830h,andthegenerationtimewere14.30,11.40,10.90and12.00h,respectively.CulturetemperaturealsohadsignificanteffectonthepopulationgrowthofT.priformis.Whentheculturetemperaturewere10℃,20℃and30℃,thepopulationgrowthratesofT.priformiswere0.0400,0.0800-1and0.0700h,andthegenerationtimewere19.80,8.55and9.59h,respectively.ComparedwithB.saltans,T.priformisexhibitthesameresponsetrend.4-1-1(3)T.priformisgrazingrateonlivebacteriawas7.43±0.09×10bac.ciliateh,while-III-\nAbstract4-1-1grazingrateonheat-killedbacteriawas5.96±0.23×10bac.ciliateh,grazingrateonlivebacteriawas1.25timesgreaterthangrazingrateonheat-killedbacteria,indicatedthatT.priformispreferfeedingonthemetabolicallyactivebacteria.(4)Whentheinitialcrudeoilconcentrationswere0.25%,0.5%,and1%,thecrudeoildegradationratesbyculturingT.priformisinwheatgrainsculturewere68.08%,60.92%and37.40%respectively.TheresultsindicatedthatculturingT.priformisinwheatgrainsculturehadastrongabilitytodegradatecrudeoil.(5)WhenthepopulationofT.priformiswasaddedintotheA.baumanniidegradingsystem,duetotheeffectsofT.priformisgrazing,thepopulationsizeofdegradingbacteriasignificantlydecreased(P＜0.01),whilethedegradingefficiencyofeachbacteriawasincreasedby5.43times(1%),9.05times(0.5%),10.40times(0.25%)respectively.Theanalysisofvarianceshowedthat:T.priformisgrazingcouldsignificantlyincreasethedegradingefficiencyofthebacteria(P＜0.01).KeywordsProtozoa,Bodosaltans,Tetrahymenapriformis,Initialfoodconcentrations,Culturetemperature,Populationgrowthrates,Acinetobacterbaumannii,Crudeoildegradation-IV-\n目录目录第1章绪论..........................................................................................................................11.1环境因子对原生动物的影响..................................................................................................11.2原生动物摄食研究进展...........................................................................................................21.2.1原生动物摄食对象多样性...........................................................................................21.2.3原生动物的摄食方式和策略......................................................................................31.2.4原生动物摄食在生态系统中的作用..........................................................................51.3研究目的和意义........................................................................................................................7第2章起始食物浓度和温度对异养鞭毛虫舞形波豆虫种群生长的影响..........................82.1材料和方法..................................................................................................................................82.1.1仪器和试剂......................................................................................................................82.1.2研究材料的分离培养....................................................................................................82.1.3研究方法...........................................................................................................................92.1.4生长参数的计算与数据处理......................................................................................92.2结果和分析................................................................................................................................102.2.1舞行波豆虫在不同起始食物浓度下的种群增长................................................102.2.2起始食物浓度对舞行波豆虫的种群生长的影响................................................102.2.3温度对舞行波豆虫种群生长的影响........................................................................112.3讨论.........................................................................................................................................132.3.1异养鞭毛虫的种群生长动态......................................................................................132.3.2起始食物浓度对舞行波豆虫种群增长的影响.....................................................132.3.3温度对舞行波豆虫种群增长的影响.......................................................................142.3.4对环境的适应性...........................................................................................................14第3章起始食物浓度和温度对梨形四膜虫种群生长的影响............................................153.1.材料和方法..............................................................................................................................153.1.1仪器和试剂....................................................................................................................153.1.2研究材料.........................................................................................................................15-V-\n目录3.1.3研究方法.........................................................................................................................163.1.4生长参数的计算与数据处理....................................................................................163.2结果.............................................................................................................................................173.2.1四组梨形四膜虫的种群增长曲线...........................................................................173.2.2不同起始食物浓度对梨形四膜虫的种群增长的影响.......................................173.2.3不同食物浓度下梨形四膜虫体积的变化...............................................................193.2.4不同温度对梨形四膜虫种群生长的影响...............................................................203.3讨论.............................................................................................................................................213.3.1起始食物浓度对梨形四膜虫种群生长的影响.....................................................213.3.2起始食物浓度对梨形四膜虫体积的影响..............................................................213.3.3温度对梨形四膜虫种群增长的影响.......................................................................22第4章细菌代谢活性对梨形四膜虫摄食率的影响............................................................234.1材料和方法................................................................................................................................234.1.1仪器和试剂....................................................................................................................234.1.2研究材料..........................................................................................................................234.1.3摄食实验方法................................................................................................................234.1.4摄食率的计算................................................................................................................244.2实验结果....................................................................................................................................244.3讨论.............................................................................................................................................24第5章用梨形四膜虫培养物降解原油实验方法初探........................................................265.1材料和方法................................................................................................................................265.1.1培养基..............................................................................................................................265.1.2梨形四膜虫的来源、分离和纯化...........................................................................265.1.3梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解..................................................................265.1.4梨形四膜虫无菌培养物对原油的降解...................................................................275.1.5原油降解率的分析........................................................................................................275.2实验结果....................................................................................................................................285.2.1梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解..................................................................285.2.2梨形四膜虫无菌培养物对原油的降解..................................................................30-VI-\n目录5.3讨论.............................................................................................................................................30第6章梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响........................................326.1材料和方法.................................................................................................................................326.1.1培养基..............................................................................................................................326.1.2鲍氏不动杆菌和梨形四膜虫的来源........................................................................336.1.3梨形四膜虫的种群生长.............................................................................................336.1.4梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响..................................346.1.5残油组分的GC-MS分析..........................................................................................346.2实验结果....................................................................................................................................356.2.1以鲍氏不动杆菌为食的梨形四膜虫种群生长......................................................356.2.2梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌种群数量的影响...........................................366.2.3梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响....................................376.2.4残油组分的GC-MS分析............................................................................................386.3讨论.............................................................................................................................................386.3.1梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌种群数量的影响.............................................386.3.2梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响....................................396.3.3残油组分的GC-MS分析..........................................................................................40第7章结语及展望................................................................................................................417.1全文总结.....................................................................................................................................417.2展望.............................................................................................................................................41参考文献..................................................................................................................................43在读期间发表的学术论文......................................................................................................49致谢......................................................................................................................................50-VII-\n第1章绪论第1章绪论原生动物是动物界最原始、最低等的动物类群。它们形体微小，一般用显微镜才能观察到，但与高等动物体内的单个细胞不同，原生动物有一般动物所表现的各种生理功能，如运动、消化、呼吸、排泄、感应、生殖等，因此它和整个高等动物相当，是一个能营独立生活的有机体。原生动物没有像高等动物那样的器官、系统，而是由细胞分化出不同的细胞器来完成各种生理机能。原生动物分布范围极广，多为世界性分布。自由生活的原生动物营养来源和摄食方式多样，是生态学研究的重要领域。1.1环境因子对原生动物种群的影响原生动物种群结构和种群增长受到各种环境因子的影响，环境因子包括生物因子和非生物因子，生物因子主要是摄食压力，非生物因子主要包括温度、pH值、食物等。大部分原生动物是食菌性的，水体中食物细菌的浓度能够影响原生动物的种群生长[1][2]动态。研究发现：细菌食物的种类和含量都会影响变形虫Acanthamoebacastellanii和Hartmammellavermiformis的生长参数。纤毛虫生长率对食物含量的反应典型的遵循一个矩形双曲线的数值反应，食物含量存在一个阈值，超过这个阈值纤毛虫生长率将不[3]再提高。另外，食物浓度的大小也会影响原生动物的摄食速度。在食物浓度低时，摄食速度与食物浓度成直线相关，即食物浓度增加摄食速度也增加，当食物浓度达到一定[4]浓度之后，食物浓度再提高，摄食速率也不再增加。温度也是决定原生动物的丰度和生产率最重要的环境因子之一，对于浮游动物的生[5]理过程，如摄食率、生长率、呼吸率以及营养再生效率具有直接影响。原生动物的生长率随着温度升高而升高，温度更高时生长率降低，但是降低程度不大，接近于生长率上限。浮游植物的光合作用是水体pH变化的主要影响因素。pH的变化会影响到水环境中各种离子的存在形式及迁移过程，从而间接影响着原生动物及其它水生生物的行为和种群消长，不同种类的原生动物对pH变化的反应是不同的。在特定的pH水平和食物浓度下，对4种纤毛虫(Balanioncomatum，Favellaehrenbergii，Rimostrombidiumcaudatum和R.veniliae)和2种腰鞭毛虫(Gyrodiniumdominas，Oxyrrhismarina)实验室培养物对pH的-1-\n河北大学理学硕士学位论文[6]耐受性进行了研究，并依据原生动物生长率的变化将被试原生动物分成两类：pH-耐受种类和pH-非耐受种类，pH-耐受种类包括B.comatum，当pH超过9.5时生长率开始下降，O.marina，pH为9.9时仍保持其最大生长率，pH-非耐受种类包括F.ehrenbergii、R.caudatum、R.veniliae和G.dominas，pH过高(pH＞9)将明显降低其生长率，甚至不能生长。由于单细胞的原生动物对环境因子变化的敏感性，现已将原生动物群落参数的变化[7]作为指标应用于水环境监测和污染源的毒性评价中。自然环境中环境因子对原生动物群落的影响是综合性的，因此研究环境因子的综合作用对异养鞭毛虫种群增长的影响是深入了解原生动物生态功能的基础。1.2原生动物摄食研究进展原生动物可以通过其选择性摄食来控制某些藻类的生长和营养盐的重新利用。因此，原生动物的摄食也很可能影响水华的发生。另外，原生动物的种间竞争、捕食竞争等生态现象都与其摄食有关，并通过其摄食行为来调控。原生动物作为有机物由初级生产向更高营养阶层转移的关键环节，其摄食率的大小将对整个生态系统的物质循环和能量流动产生影响，是建立海洋生态系统动力学模型的关键参数之一。1.2.1原生动物摄食对象的多样性原生动物物种丰富，摄食方式多样，但生态学研究者曾长期将原生动物视为单一的菌食者类群。最近的研究表明，原生动物从食物种类到摄食方式都具有种的特异性，既有摄食浮游藻类的种类，也有可摄食其它的原生动物或者小的后生动物的种类。其食性包括菌食性(Bacerivores)、植食性(Herbivores)、食碎屑(Detritivores)和渗透营养(Osmotrophs)等，有些种类为混合营养(Mixotrophy)。原生动物所摄食的食物颗粒范围[8]非常广泛，除细菌和超微型浮游植物外，还能够摄食大分子物质，如分子量为55-2000[9][10]kd的可溶性有机物质(DOM)、可溶性生物大分子如蛋白和多糖等；一些群体性异养鞭毛虫，尤其是领鞭虫，甚至能够摄食水体中的病毒和其它直径为50nm大小的颗粒[11]。原生动物食物种类和摄食方式的多样性使其在微生物食物网中占据重要的生态地位。-2-\n第1章绪论1.2.2原生动物对食物的选择性菌食性原生动物对所食细菌具有选择性，即周围环境中的细菌并不是以同等效率被原生动物摄食。代谢活跃、生长迅速的细菌是菌食性原生动物优先摄取的对象。在可摄食粒径范围内，菌食性原生动物优先摄食个体较大且代谢活跃的细菌，回避个体较小且代谢不活跃的细菌，个体较大的细菌(0.4~0.8µm)占被食菌总量的61.6±6.9%，对活细[12][13]菌的摄食率高出死细菌1.83倍。原生动物能选择性摄食生长迅速的细菌，其原因可能是由于原生动物对细菌释放的化学物质具有趋化性，而代谢旺盛生长迅速的细菌可[14]以分泌更多的化学物质，如葡萄糖代谢菌比其它细菌面临更大的摄食压力。细菌和原生动物本身细胞表面的疏水性同样会影响原生动物对食物的选择。哺乳动物免疫细胞吞噬细菌的研究表明：免疫细胞对细菌的吞噬效率随细菌表面疏水性的增加[15,16]而提高。由此推测，原生动物摄食悬浮细菌的过程也可能存在类似的机制。由于水环境中不同种类的细菌和超微型浮游植物表面疏水性的差异，会影响它们与原生动物的[17]接触机率，从而影响原生动物的摄食率和选择性。Monger研究证实，鞭毛虫(Bodosaltans,Spumellapudica,Ochromonassp.)对疏水性高的超微型浮游生物具有更高的清除率。原生动物本身的疏水性也能影响其摄食率，如果原生动物本身表面张力(和疏水作用相反的力)低于水体的表面张力时，就会优先摄食疏水性高的细菌；而如果表面张力高于水体的表面张力，就会表现出相反的摄食选择；如果表面张力与水体的表面张力相同，[15]则不存在对食物疏水性的选择。但也有学者对此有不同的结论，Matz和Jurgens则认[18]为：细菌表面疏水性的差异不会显著影响原生动物的摄食率和选择性。关于这方面的研究还有待进一步证实。原生动物对食物的选择还受其它因素的影响，如细菌的形状、[19]菌体大小以及水体的涡流等都可能影响其摄食率。1.2.3原生动物的摄食方式和策略根据与基质接触的紧密程度，自由生活的异养鞭毛虫可分成三类：(1)自由游泳生活的种类(如尖眼虫，腰鞭毛虫，大型金滴虫类)；(2)靠原生质丝或鞭毛疏松地或暂时性附着生活的种类(如小型金滴虫类，波豆虫、杯鞭虫)；(3)附着生活的种类(一些有壳杯[20]鞭虫和领鞭虫)，其中后两类至少占总生物量的一半。在水体中悬浮颗粒表面的细菌量比周围水体要多，鞭毛虫在悬浮颗粒表面附着生活有利于其克服水流的影响而增加摄-3-\n河北大学理学硕士学位论文[21]食率。在底栖环境中细菌数量可达上层水体的三倍，因此细菌是底栖异养鞭毛虫最主要的食物来源。底栖鞭毛虫的摄食常由特化的摄食胞器辅助完成，尤其是那些摄取紧密粘附细菌的种类。由于水体微环境变化多样，极其复杂，为了更有效地摄食，异养鞭毛虫形成了多样化的摄食方式，主要包括滤食(filter-feeding，如领鞭毛虫)、截食(interception-feeding，[20]如金滴虫)和主动捕食(raptorial-feeding，如波豆虫)等。滤食依靠鞭毛、伪足触须或微绒毛的摆动引起水流达到过滤食物的作用；截食是鞭毛虫以静止状态捕食运动速度较快的食物；主动捕食是以通过捕食者运动引起的水流来捕获食物。大型鞭毛虫一般通过偶然性接触捕食个体较大的食物颗粒(如藻类和其它原生动物)或通过鞭毛摆动所引起[22]的水流将小颗粒物聚集到身体周围来摄食。对于个体微小的异养鞭毛虫来说，自身的运动和食物颗粒的扩散都是影响摄食的重要因素，一些细菌的运动速度每秒可达几百微米，充分利用细菌的运动就会增加异养鞭毛虫的摄食机率。一些鞭毛虫可以通过伪足、类似伪足的结构(金滴虫和多种腰鞭毛虫)、咽(大部分波豆虫和眼虫)或者其它的机制辅助摄食，这是在低食物浓度条件下生存的一个重要适应机制。常见菌食性异养鞭毛虫的摄食方式如图1所示。即使是个体大小相同或相近的种类，摄食方式和摄食策略也不相同。异养鞭毛虫摄食策略的多样化和适应性也促进了细菌反捕食机制的进化。经过长期的协同进化，细菌和异养鞭毛虫方都相互形成了一系列形态、生理和生态的适应性特征。细菌形成了防御策略来阻止自身被原生动物摄取(摄取前策略)或消化(摄取后策略)。如带菌丝细菌的出现就是一个很重要的反捕食策略。-4-\n第1章绪论[4]图1.1异养鞭毛虫摄食食菌的方式[4]Fig.1.1Feedingofdifferentbacterivorousheterotrophicflagellates滤食者Filter-feeding(1.单领鞭毛虫Monosiga;2.Choanoecaperplexa)；拦截摄食者Interceptionfeeding(3.金滴虫Spumella，4.双滴虫Diplomonad，5.舞行波豆虫Bodosaltans，6.杯鞭虫Bicosoeca)；通过咽主动摄食Raptorialfeedingbyapharynx(7.波豆虫Biodonid)；靠类似伪足的结构摄食Feedingbypseudopodlikestructures(8.尾滴虫Cercomonas)。1.2.4原生动物摄食在生态系统中的作用1.2.4.1原生动物摄食在物质循环中的作用原生动物是微生物环中重要的成员，其食性广泛，占据重要的生态位，它能将细菌等低营养级生物的产量向更高的营养级转移。异养细菌是水域生态系统中有机物质的主[12]要的也是有效的利用者，可溶性有机物质(DOM)是自然水体中总的有机物质的重要部分，细菌能将可溶性有机物质(DOM)转化为自身的生物量，原生动物摄食细菌是大部分可溶性有机物质(DOM)发生转移的原因之一。原生动物对细菌的摄食速度是惊人33的，其摄食率为每小时1.2×10~5.1×10个细菌。原生动物摄食促进了细菌的生长，使细菌生长总保持在对数生长期，防止了细菌种群的衰老，增加了细菌对营养物质的利用率。同时原生动物还能通过摄食微型浮游植物增加其对营养物质的竞争，促进微型浮游植物的生长，从而有利于水体中营养物质的周转和再生。1.2.4.2原生动物摄食在能量流动中的作用-5-\n河北大学理学硕士学位论文原生动物的摄食率是决定微食物环中能量流动的一个重要的因素，因为原生动物的[23]代谢速率非常快，通过其摄食从而促进了整个微食物环中能量转化的效率。Cole等的研究结果表明，在海洋中平均60%初级生产力进入微型食物网中。这表明微食物环在海[24]洋生态系统能量传递上是十分重要的途径。Wikner等指出，由于在许多浮游生物生态系统中，小型的鞭毛虫类是细菌的主要消费者，所以它们在决定初级生产的能量流向上[25]起关键作用。Solic在亚得里亚海的研究中指出，被摄食的细菌总数中有80%是由原生动物摄食的，约有32%的细菌生产量流入原生动物的生物量中。1.2.4.3原生动物摄食对营养盐类矿化和再生的作用原生动物在营养物质(主要是氮磷)的再生过程中起着重要作用。Caron等指出，原+3-生动物能释放出其食物中相当一部分的营养盐类(如NH4和PO4)，这表明原生动物摄食是海洋中营养盐再生的重要途径之一。原生动物在营养物质(主要是氮磷)的再生过程[26]中所起的作用和食物的营养状态相关。研究表明，以不同营养状态的硅藻和细菌为食时，原生动物培养物中磷的再生效率不同，也就是说食物的生理状态对原生动物摄食过程中磷的再生效率有影响。其它研究显示，原生动物在摄食过程中还能释放出溶解有机碳、溶解游离氨基酸等有机物，将有利于促进细菌的生长和营养元素的再生。另外，原生动物摄食过程中也会释放出溶解有机磷，例如可溶性DNA，它是海洋细菌的一个潜在的磷来源。1.2.4.4原生动物摄食在细菌生物降解中的作用原生动物的摄食压力在一些条件下能够增加作为其食物的细菌的代谢活性。最近，[27]Holubar等发现：食菌性纤毛虫提高了石化活性淤泥过程中的化学需氧量的降低速率。[28]另有研究显示，纤毛虫Colpidiumcolpoda的摄食能够增强降解菌对原油的生物降解。其原因可能是纤毛虫可以增强细菌的活性，并且由于纤毛虫代谢分泌也可以引起污染性[29]碳水化合物的降解。Mattison和Harayama建立了一个食物链模型来研究鞭毛虫摄食对细菌降解甲苯的影响，他们发现当食菌性鞭毛虫Heteromitaglobosa存在时，Pseudomonassp.菌株PS+降解甲苯的速率显著提高。上述研究表明了原生动物在生物降解的过程中的潜在作用。-6-\n第1章绪论1.3研究目的和意义综上所述，原生动物生态学的研究已经成为水生物生态学的热点领域之一。随着研究方法的完善，人们对原生动物的研究更加深入，对原生动物的分布、分类、丰度，以及对生态系统物流与能流的贡献有了新的认识。原生动物摄食特征及其与细菌关系的系统研究，是我们更深入了解其生态特征的重要前提。本文通过研究初始食物浓度和温度对代表性原生动物舞行波豆虫(Bodosaltans)和梨形四膜虫(Tetrahymenapriformis)种群生长的研究，探讨两种重要环境因子对原生动物种群生长的影响；研究细菌活性对原生动物摄食和种群增长的影响，探讨原生动物选择性摄食机制；研究梨形四膜虫与原油降解菌鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的相互作用，及其对鲍氏不动杆菌降解原油效率的影响，探讨原生动物在生物降解中作用。上述研究将有助于对原生动物生态功能的了解，为相关研究提供基础资料。-7-\n河北大学理学硕士学位论文第2章起始食物浓度和温度对异养鞭毛虫舞形波豆虫种群生长的影响异养鞭毛虫(Heterotrophicflagellate)是水生态系统中超微型浮游生物的主要摄食[30]者，能够消费60%以上的细菌种群，是营养物质矿化的重要环节。异养鞭毛虫种类丰富，摄食方式多样，是构成微食物环的重要环节，在水生态系统中占有重要地位。[31]异养鞭毛虫的种群生长受多种因素的影响，其中食物浓度和温度起着关键作用。舞行波豆虫是淡水中常见的异养鞭毛虫，隶属于原生动物门动机体目(Kinetoplastida)，主要以细菌为食。本文在实验室条件下通过控制初始食物浓度和温度，研究起始食物浓度和温度对舞行波豆虫种群动态的影响，以了解异养鞭毛虫种群动态特征，也为探讨异养鞭毛虫在水域生态系统中的作用提供参考。2.1材料和方法2.1.1仪器和试剂聚氨酯泡沫塑料块(PolyurethaneFoamUnit，PFU)，电子天平，倒置显微镜，恒温培养箱，麦粒，酵母粉，蛋白胨，NaCl，1mol/L的NaOH，1mol/L的HCl。2.1.2研究材料的分离培养实验用舞行波豆虫用聚氨酯泡沫塑料块(PolyurethaneFoamUnit，PFU)采自公园池塘，实验室内分离、纯化得到单克隆种群。异养鞭毛虫的分离纯化方法有多种，它们在很大程度上是相同的——首要目的是为了获得单一的细胞。主要的步骤是——采集水样→加富→分离→再分离养等。本实验采用PFU方法采集水样，由于采集回来的水样中原生动物的密度还是不高，因此首先需要进行加富培养。加富是指在所采集的水样中添加适量培养基或者有机物以增加水中的细菌和藻类等食物的浓度，并在有利的条件下培养，使异养鞭毛虫的密度迅速增加，以便进行下一步分离、筛选操作，加入的有机物可以使用酵母提取物、蛋白胨等，本实验中采用麦粒进行富集培养。分离方法采用微液滴-8-\n第2章起始食物浓度和温度对异养鞭毛虫舞形波豆虫种群生长的影响分离，反复多次分离出舞行波豆虫的单克隆培养物。用麦粒繁殖细菌，细菌分离纯化后用LB培养基培养，热杀死后离心收集菌体，作为舞行波豆虫的食物。2.1.3研究方法2.1.3.1起始食物浓度的设定首先进行预实验以确定适宜的初始食物浓度范围。根据预实验结果，取处于对数生6长期的舞行波豆虫用作实验种群，设置4个初始食物浓度，分别为2.10×10cell/mL(A666组)、2.80×10cell/mL(B组)、4.20×10cell/mL(C组)、6.40×10cell/mL(D组)，每个食物浓度下设置三个平行。实验温度为20℃，用蒸馏水作培养液，总体积为5mL，舞行波豆虫初始密度均为500cell/mL。每隔8h取样一次，对舞行波豆虫进行计数。计数方法：先将培养液吹打均匀，定量吸取10μl培养液于计数板上，在倒置显微镜下全片计数。如果虫体密度过高，则适当稀释后计数。2.1.3.2温度对舞行波豆虫种群生长的影响设置三个温度梯度，分别为10℃、20℃和30℃，初始虫体数量相同，每个温度设三个平行。正式实验前对舞行波豆虫进行2~5d温度适应，在10℃下的适应期最长。适应期过后，取一定数量处于对数生长期的舞行波豆虫，每一平行中加入100μl处于对数生长期的菌液为食。培养液总体积为5mL，每隔8h取样一次，对舞行波豆虫进行计数。计数方法同上。2.1.4生长参数的计算与数据处理种群生长率(r)及世代时间(G)的计算方法：根据公式rt=lnNt-lnN0，其中Nt为经过时间t后的种群密度(计算种群增长率时只取种群增长期t对应的种群密度)，N0为种群初始密度。种群增长率通过回归分析后得出，以时间为横坐标，以种群增长期虫体密度的自然对数为因变量，其斜率即为种群生长率r。根据公式G=ln2/r，代入上述所得r[32]值，以获其世代时间G。-9-\n河北大学理学硕士学位论文2.2结果和分析2.2.1舞行波豆虫在不同起始食物浓度下的种群增长不同初始食物浓度下舞行波豆虫的种群生长曲线见图2.1，四组舞行波豆虫的种群增长曲线均可拟合为抛物线。各组在8h后均表现为明显的生长，舞行波豆虫种群数量经指数增长达到最大后，种群数量骤然下降，没有稳定的平衡期。图2.1不同起始食物浓度下舞行波豆虫的种群生长曲线(A、B、C、D起始食物浓度分别为：2.10、62.80、4.20和6.40×10cell/mL)Fig.2.1GrowthcurvesofB.saltansunderdifferentinitialfoodconcentrations(A,B,C,Dinitialfood6concentrationwas2.10、2.80、4.20and6.40×10cell/mL)2.2.2起始食物浓度对舞行波豆虫的种群生长的影响表2.1中列出了不同起始食物浓度下舞行波豆虫的种群参数，当起始食物浓度为62.80×10cell/mL时，舞行波豆虫种群生长率最高。方差分析结果表明，起始食物浓度对-10-\n第2章起始食物浓度和温度对异养鞭毛虫舞形波豆虫种群生长的影响种群生长率具有极显著的影响(P＜0.01)。起始食物浓度升高，舞行波豆虫种群生长率r增大(A、B组)；起始食物浓度继续升高，舞行波豆虫种群生长率r反而减小(C、D组)。表2.1不同起始食物浓度下舞行波豆虫的种群参数Table2.1PopulationparametersofB.saltansunderdifferentinitialfoodconcentrations-1食物起始浓度(cell/mL)种群生长率r(h)世代时间G(h)InitialfoodconcentrationPopulationgrowthrateGenerationtime62.10×10(A组)0.1166ac±0.00305.90±0.1562.80×10(B组)0.1376b±0.00405.00±0.1564.20×10(C组)0.1202ac±0.00105.80±0.0666.40×10(D组)0.1128d±0.00206.10±0.01不同食物起始浓度对舞行波豆虫种群动态的影响存在差异，种群数量达到最大值所需要的时间不同，并且各组舞行波豆虫种群所能达到的最大密度也不相同。A组最大值4444为2.80×10cell/mL，B组为3.88×10cell/mL，C组为1.04×10cell/mL，D组为0.32×10cell/mL。统计分析结果显示：食物起始浓度和培养时间以及两者间的交互作用对舞行波豆虫的种群数量均具有显著影响(见表2.2二维方差分析，P＜0.05)。表2.2食物起始浓度和培养时间对舞行波豆虫种群生长影响的二维方差分析Table2.2Two-wayANOVAofinitialfoodconcentrationandculturetimeeffectonthegrowthofB.saltanspopulationFP-level食物起始浓度4.84900.0110(Initialfoodconcentration)培养时间3.14000.0180(Culturetime)食物起始浓度×培养时间3.24800.0110(Initialfoodconcentration×Culturetime)2.2.3温度对舞行波豆虫种群生长的影响培养温度对舞行波豆虫种群动态影响很大，在不同温度下舞行波豆虫表现出了不同的生长特征(图2.2)。当培养温度为10℃时，整个实验过程中舞行波豆虫种群数量呈缓慢上升的趋势，增长幅度不大。在20℃和30℃的培养条件下，舞行波豆虫种群均在8h4后快速增长，20℃时舞行波豆虫种群在24h后达到最大密度，最大值为3.13×10cell/mL；-11-\n河北大学理学硕士学位论文430℃时舞行波豆虫种群在32h后达到最大密度，最大值为2.58×10cell/mL。培养温度为20℃时，舞行波豆虫种群达到的最大密度在3组中最高。图2.2不同温度下舞行波豆虫的种群生长曲线Fig.2.2GrowthcurvesofB.saltansunderdifferenttemperatures不同温度下舞行波豆虫的种群参数见表2.3。当培养温度为20℃时，种群增长率最大，10℃时的种群生长率远低于20和30℃的种群生长率。培养温度从10℃升高到20℃时，种群生长率升高到10℃时2.49倍。表2.3不同温度下舞行波豆虫的种群参数Table2.3PopulationparametersofB.saltansunderdifferenttemperatures-1温度(℃)种群生长率r(h)世代时间G(h)TemperaturePopulationgrowthrateGenerationTime100.0500a±0.001013.86±0.04200.1246bc±0.00605.60±0.03300.1203bc±0.02105.80±1.23在实验过程中，发现温度会影响到舞行波豆虫的运动速度。当水温低至4℃左右时，虫体游动速度缓慢，但未观察到形成包囊现象。-12-\n第2章起始食物浓度和温度对异养鞭毛虫舞形波豆虫种群生长的影响2.3讨论2.3.1异养鞭毛虫的种群生长动态不同类群异养鞭毛虫种群的最大生长率(Populationmaximumgrowthrate)差异很大。淡水生态系统中，体长2-20μm的常见异养鞭毛虫类群有动机体类(kinetoplastids)、领鞭毛虫类(Choanoflagellates)、以及无色裸藻类(ColorlessEuglenoidFlagellate)等。本-1文中舞行波豆虫属于动机体类，实验室条件下种群最大生长率为0.1376h，与已报道的其它动机体种类相近。如实验室条件下20℃时Bododesignis种群最大比生长率为0.16-1[33]-1[34]h，Bodoedax为0.16h；已报道的领鞭毛虫类的种群最大比生长率低于动机体类，-1[35]如Codosigagracilis为0.052h。由于温度、食物浓度的差异，自然环境中异养鞭毛虫群落生长率远低于实验室种群，如在培养温度为5~15℃时，寡营养湖泊LochNess湖-1[36]异养鞭毛虫群落比生长速率为0.043到0.093h。从实验结果看，在适宜的温度和食物浓度下，舞行波豆虫种群在进入快速增长期之前仅有一个较短的停滞期，之后种群快速增长，种群密度达到最高后迅速下降。Taylor[37]等从生态学角度上将这一现象解释为原生动物对外界环境反应的一种生态策略。不同原生动物种群的停滞期存在差异。实验室条件夏巨大拟阿脑虫生长停滞期时间为12~36[32]h，梨形四膜虫的停滞期时间为16h左右(待发表)，而舞行波豆虫的停滞期时间小于8h，表明个体相对较小的舞行波豆虫种群对环境变化能够更迅速的做出反应，条件适宜时，种群迅速暴发。2.3.2起始食物浓度对舞行波豆虫种群增长的影响6本实验中当初始食物浓度为2.80×10cell/mL时，舞行波豆虫种群密度达到最大值，初始食物浓度继续升高，种群密度所达的最大值反而减小。本实验以热杀死的细菌为食物，排除了因细菌快速繁殖造成水质恶化，以及细菌分泌代谢物质对鞭毛虫生长造成影响的可能性。从舞行波豆虫的生活方式看，属于附着型生活方式，过高的食物颗粒可能影响其对容器壁的附着，这可能是造成食物浓度过高而舞行波豆虫种群密度反而减小的一个原因。原生动物种类多样，不同种类对食物浓度的反应根据其生境、摄食方式和生活方式的不同而不同，最适的初始食物浓度范围也存在差异。William研究了5种食菌性-13-\n河北大学理学硕士学位论文[38]纤毛虫对其细菌食物丰度的反应，发现纤毛虫对食物浓度的反应存在种间差异。2.3.3温度对舞行波豆虫种群增长的影响水温不仅影响原生动物的摄食率，而且会影响其代谢速率和细胞分裂时的能量需求。本实验结果表明，温度对舞行波豆虫种群生长有显著影响，20℃时种群最大生长率为10℃时的2.49倍。鞭毛虫Paraphysomonasimperforata的结果与舞行波豆虫类似，在[39]14-26℃的范围内，种群生长的温度系数Q10为2.5。在原生动物生存温度范围内，种群生长率随着温度升高而升高，温度接近于生存极[39,40]限时生长率降低，但是降低程度不大，接近于生长率上限。我们的实验结果表明：舞行波豆虫在20℃时增长率最大，且至30℃时仍保持较高的生长率，表明异养鞭毛虫舞行波豆虫种群生长有一个较为广泛的适温范围。2.3.4对环境的适应性自然环境中生活的原生动物对食物的丰欠和温度的变化形成了多种适应机制，包括形成复杂的生活周期(如形成包囊度过不良环境)、多样化的摄食方式以及当食物条件变[41]化时调控自身代谢的能力。多种异养鞭毛虫在不良环境条件下可形成休眠包囊，但在本实验中未见舞行波豆虫形成休眠包囊。为了能够更有效地摄食，异养鞭毛虫形成了多样化的摄食方式，包括滤食(filter-feeding)、截食(interception-feeding)和主动捕食[42](raptorial-feeding)等。B.saltans通过主动捕食摄食细菌，通过自身运动引起的水流来捕获食物。当食物缺乏时，一些原生动物能够通过降低代谢水平来延长生存时间，使其能够寻找到适宜的生境条件。如异养腰鞭毛虫Gyrodiniumspirale能够通过降低新陈代谢[43]水平延长生存时间。但从本实验舞行波豆虫的生长曲线看，它未表现出这种适应机制。舞行波豆虫主要通过快速大量繁殖，以便对环境条件的变化作出迅速反应。-14-\n第3章起始食物浓度和温度对四膜虫种群生长的影响第3章起始食物浓度和温度对梨形四膜虫种群生长的影响原生动物的生长特征是研究了解原生动物的生产量、生态效率的重要参数。温度和食物浓度是影响浮游动物种群增长和繁殖的重要生态因子。温度是决定浮游生物丰度和生产率最重要的环境因子之一，对于浮游动物的生理过程，如摄食率、生长率、呼吸率[39]以及营养再生效率具有直接影响。温度对原生动物生长的影响也会进一步影响到高营养等级生物的能量及营养来源。作为浮游生物四大类群之一的原生动物大部分种类是食[44-47]菌性的，水体中细菌的浓数量能够影响原生动物的种群生长动态。有关食物、温度[48-50]等环境因子对轮虫、枝角类等大型浮游动物种群动态的影响已有较多报道，但有关温度和食物浓度对原生动物种群动态影响的报道却不多。原生动物种类多样，对食物浓度和温度的反应因其生境、摄食方式和生活方式的不同而存在差异。本文通过控制初始食物浓度和温度，研究不同起始食物浓度和温度对淡水中常见种类梨形四膜虫(Tetrahymenapriformis)种群动态的影响，以丰富该领域的研究内容，也为探讨纤毛虫在水域生态系统中的作用提供参考。3.1.材料和方法3.1.1仪器和试剂聚氨酯泡沫塑料块(PolyurethaneFoamUnit，PFU)，电子天平，倒置显微镜，恒温培养箱，麦粒，酵母粉，蛋白胨，NaCl，1mol/L的NaOH，1mol/L的HCl。3.1.2研究材料实验用梨形四膜虫用聚氨酯泡沫塑料块(PFU)采自公园池塘，实验室内分离、纯化得到单克隆种群。实验室内麦粒繁殖细菌，细菌分离纯化后用LB培养基培养，热杀死后离心收集菌体，作为梨形四膜虫的食物。-15-\n河北大学理学硕士学位论文3.1.3研究方法3.1.3.1起始食物浓度的设定首先进行预实验以确定适宜的初始食物浓度范围。根据预实验结果，取处于对数生6长期的梨形四膜虫用作实验种群，设置4个初始食物浓度，分别为7.50×10cell/mL(A777组)、1.50×10cell/mL(B组)、3.00×10cell/mL(C组)、6.00×10cell/mL(D组)，每个食物浓度下设置三个平行。实验温度为20℃，培养液总体积为5mL，梨形四膜虫初始密度均为300cell/mL。每隔8h取样一次，用甲醛固定(终浓度为2%)，对梨形四膜虫进行计数，并用测微尺测量30个虫体的长和宽，假定纤毛虫为扁长球体来计算其体积。3.1.3.2温度对梨形四膜虫种群生长的影响设置三个温度梯度，分别为10℃(A组)、20℃(B组)、30℃(C组)，每个温度下设三个平行。正式实验前对梨形四膜虫进行2~5d温度适应，在10℃下的适应期最长。适应期过后，取一定数量处于对数生长期的梨形四膜虫，每一平行中加入1mL处于对数生长期的菌液为食。培养液总体积为5mL，每隔8h取样一次，对梨形四膜虫进行计数。计数方法同上。3.1.4生长参数的计算与数据处理种群自然增长率(r)及世代时间(G)的计算方法：根据公式rt=lnNt-lnN0，其中Nt为经过时间t后的种群密度，N0为种群初始密度。增长率进行回归分析得出，以时间为横坐标，因变量是虫体密度的自然对数，其斜率即种群自然增长率r。根据公式G=ln2/r，[32]代入上述所得r值，以获其世代时间G。用温度系数Q10表示温度每升高10℃种群自然增长率的相对变化，其计算公式为：10/(T2-T1)[51]Q10=(r2/r1)，式中r2和r1分别为在温度T2和T1下的种群自然增长率。-16-\n第3章起始食物浓度和温度对四膜虫种群生长的影响3.2结果图3.1不同食物浓度下梨形四膜虫的种群增长曲线Fig3.1GrowthcurvesofT.priformisunderdifferentinitialfoodconcentrations3.2.1四组梨形四膜虫的种群增长曲线不同初始食物浓度下梨形四膜虫种群生长曲线见图3.1。在整个实验过程中，四组梨形四膜虫均在16h后表现为明显的指数级生长，A、D组并没有观察到梨形四膜虫的生长出现明显的平缓期，B、C组出现平缓期。3.2.2起始食物浓度对梨形四膜虫的种群增长的影响食物起始浓度对梨形四膜虫种群动态的影响存在差异。统计分析结果显示：食物起始浓度和培养时间以及两者间的交互作用对梨形四膜虫的种群数量均具有极显著影响(见表3.1两维方差分析，P＜0.01)。-17-\n河北大学理学硕士学位论文表3.1食物起始浓度和培养时间对梨形四膜虫种群生长的影响(二维方差分析结果)Table3.1EffectsofInitialfoodconcentrationandculturaltimeonthegrowthofT.priformisPopulation(Resultsoftwo-wayANOVA)FP-level食物起始浓度*18.3990.000(Initialfoodconcentration)培养时间*7.1010.001(Culturaltime)食物起始浓度×培养时间*22.6360.000(Initialfoodconcentration×Culturaltime)*在0.05水平上差异极显著表3.2中列出了不同起始食物浓度下梨形四膜虫的种群参数，当起始食物浓度为73.00×10cell/mL时，梨形四膜虫种群自然增长率最高，方差分析结果表明，起始食物浓度对种群自然增长率具有极显著的影响(P＜0.01)。起始食物浓度升高，梨形四膜虫种群自然增长率r增大(A、B、C组)；起始食物浓度继续升高，梨形四膜虫种群自然增长率r反而减小(D组)。表3.2不同起始食物浓度下梨形四膜虫的种群参数Table3.2PopulationparametersofT.priformisunderdifferentinitialfoodconcentrations-1食物起始浓度(cell/mL)种群自然增长率r(h)世代时间G(h)InitialfoodconcentrationnaturalrateofincreaseinpopulationGenerationtime67.5×100.0700a±0.00414.3071.5×100.0870bcd±0.00211.4073.0×100.0920bc±0.00310.9076.0×100.0830bd±0.00512.00-18-\n第3章起始食物浓度和温度对四膜虫种群生长的影响3.2.3不同食物浓度下梨形四膜虫体积的变化图3.2不同起始食物浓度下梨形四膜虫体积的变化Fig3.2ChangesinvolumeofT.priformisunderdifferentinitialfoodconcentrations不同起始食物浓度条件下梨形四膜虫体积的变化见图3.2。从整个实验过程中梨形四膜虫体积变化来看，基本趋势是：实验初始阶段的体积比较小，在丰富的食物条件下，梨形四膜虫体积增大，随着梨形四膜虫数量的增加，食物开始减少，梨形四膜虫体积开始缓慢下降。在不同的起始食物浓度条件下，起始食物浓度最大时(A组)这种变化趋势最明显。起始食物浓度对梨形四膜虫体积影响的方差分析结果见表3.3，结果表明：在8h、16h时起始食物浓度对体积的影响差异不显著(P＞0.05)，从24h起开始出现极显著差异。表3.3起始食物浓度对梨形四膜虫体积的影响(一维方差分析结果)Table3.3EffectsofinitialfoodconcentrationonthevolumeofT.priformis(Resultsofone-wayANOVA)时间(h)FP81.5840.205162.1850.094*246.2660.001*3210.0400.000*4057.7520.000*4850.8000.000*5639.4290.000*6469.1110.000*在0.05水平上差异极显著-19-\n河北大学理学硕士学位论文3.2.4不同温度对梨形四膜虫种群生长的影响图3.3不同温度下梨形四膜虫的种群生长曲线Fig3.3GrowthcurvesofT.priformisunderdifferenttemperatures不同温度对梨形四膜虫种群动态影响很大，在不同温度下梨形四膜虫表现出了不同的生长特征(图3.3)。在10℃条件下，整个实验过程中梨形四膜虫种群呈上升的趋势，处于指数生长阶段，但是增长的幅度不大，方差分析结果表明10℃时种群自然增长率与20℃和30℃相比存在极显著差异(P＜0.01)。20℃和30℃条件下，梨形四膜虫种群均在8h后快速增长，但种群自然增长率存在差异，但两者差异不显著(P＞0.05)。表3.4中列出了不同温度下梨形四膜虫的种群参数，20℃时种群自然增长率最高。表3.4不同温度下梨形四膜虫的种群参数Table3.4PopulationparametersofT.priformisunderdifferenttemperature-1温度()℃种群自然增长率r(h)世代时间G(h)TemperaturenaturalrateofincreaseinpopulationGenerationTime100.04a±0.00219.80200.08bc±0.0048.55300.07bc±0.0039.59据表3.4结果及温度系数计算公式得出：温度从10℃升高到20℃时，梨形四膜虫的温度系数Q10为2.32。-20-\n第3章起始食物浓度和温度对四膜虫种群生长的影响3.3讨论3.3.1起始食物浓度对梨形四膜虫种群生长的影响随着起始食物浓度的增加，梨形四膜虫种群自然增长率增大，当起始食物浓度继续升高，其种群自然增长率反而减小。因此，此纤毛虫和食物之间存在一个合适的比例，初始食物浓度过高或者过低都将影响其生长，只有在合适的初始食物浓度条件下，才能获得最佳的生长状态。在食物浓度较低的情况下，梨形四膜虫种群生长主要受到食物因子的限制，故种群自然增长率随着起始食物浓度的增加而增加，但随着种群数量的增加，高密度虫体的代谢使水质恶化，食物、种内竞争以及自身代谢废物的影响都将影响其种群生长，故种群数量达到最大值后出现随之下降的现象。海洋纤毛虫巨大拟阿脑虫的种群生长也有类似现象，种群自然增长率随食物密度的增大而增大，当食物密度为2.8E+08ind./mL时，种群自然增长率达最大值为2.07/d，当食物密度继续增加种群自然增长率下[32][52]降。Weisse指出：纤毛虫生长率对食物含量的反应典型的遵循一个矩形双曲线的数值反应，食物含量存在一个阈值，超过这个阈值纤毛虫生长率将不再提高。7起始食物浓度为3.0×10cell/mL时，梨形四膜虫种群自然增长率达最大值0.08/h，此值相对原位生长率较高，因为环境中细菌的含量相对要低。在此研究中，细菌浓度要比45自然界中高出2~3个数量级，自然界中细菌含量大约为10~10/mL。3.3.2起始食物浓度对梨形四膜虫体积的影响对于不同生长期的原生动物的生长特征，细胞体积是一个很重要的参数，因为细胞体积不仅仅影响到计算其生物量，而且影响其它的生理特征，如呼吸率也跟细胞的体积[53]有关。有研究指出，原生动物的呼吸率与细胞体积有正比的关系。原生动物能够通过细胞膜与外界进行气体交换，此种呼吸方式要求原生动物有相对较大的表面积。食物浓度变化引起原生动物体积变化，使其在不同生长时期体积存在一定差异，这种体积上的差异对计算其生物量、生态效率的影响很大。从本实验过程中梨形四膜虫体积变化来看，基本趋势是：实验初始阶段体积比较小(主要是因为实验选取的梨形四膜虫原来处于生长的平缓期)，在丰富的食物条件下，梨形四膜虫体积增大，随着梨形四膜虫数量的迅速增加，食物开始减少，梨形四膜虫体积-21-\n河北大学理学硕士学位论文开始缓慢下降。食物浓度的变化对梨形四膜虫体积存在很大的影响，方差分析结果表明：在8h、16h时起始食物浓度对体积的影响差异不显著(P＞0.05)，从24h起开始出现极显著差异。梨形四膜虫通过调整其体积大小来适应变化的食物浓度，这可能是其适应环境变化的一种机制。个体在进入新的环境后，通过推迟分裂时间(停滞期)来达到其最大体积，在体积增大到一定程度之后，大细胞将不停分裂直至达到种群最大数量(平缓期)，这样可以提高个体寻找其它食物来源的可能性，从而保证了种群的生存和繁衍。3.3.3温度对梨形四膜虫种群增长的影响水温不仅影响原生动物的摄食率，而且会影响其代谢速率和细胞分裂时的能量需求。以温度系数Q10值来表示温度升高后的反应速率与原来速率的比值，探讨原生动物Q10的生物指标一般为种群自然增长率。本实验结果表明，温度对梨形四膜虫种群生长的影响与其它原生动物及藻类类似，即温度每升高10℃，生化过程的速率即加快大约2倍。从10℃升高到20℃时梨形四膜虫的温度系数为2.32，与Fenchel报导的需氧海洋纤[39]毛虫的温度系数2.3~3.5的结果相近。藻类的温度系数为1.9左右，大部分纤毛虫的温度系数要高于藻类，表明纤毛虫对温度的反应更敏感。在原生动物生存温度范围内，种群生长率随着温度升高而升高，温度接近于生存极[39,40]限时生长率降低，但是降低程度不大，接近于生长率上限。如淡水种厌氧纤毛虫[54]Plagiopylanasuta生长率在18℃达最大，在18~24℃范围内并不增加。本实验结果表明：梨形四膜虫在20℃时增长率最大，且至30℃仍保持较高的生长率，表明此原生动物种群生长有一个较为广泛的适温范围。-22-\n第4章细菌代谢活性对四膜虫摄食率的影响第4章细菌代谢活性对梨形四膜虫摄食率的影响原生动物以其食菌性的种类为最多，原生动物对细菌的选择性受多种因素的影响。[55,56]细菌的细胞形态、大小和代谢活性都可能影响到原生动物对细菌的摄食率。本文通过热杀死的方法控制细菌代谢活性，研究了细菌代谢活性对其摄食率的影响，以丰富该领域的研究内容，也为探讨纤毛虫在水域生态系统中的作用提供参考。4.1材料和方法4.1.1仪器和试剂聚氨酯泡沫塑料块(PolyurethaneFoamUnit，PFU)，电子天平，倒置显微镜，恒温培养箱，麦粒，酵母粉，蛋白胨，NaCl，1mol/L的NaOH，1mol/L的HCl。4.1.2研究材料实验用梨形四膜虫(Tetrahymenapriformis)用聚氨酯泡沫塑料块(PFU)采自公园池塘，实验室内分离、纯化得到单克隆种群。实验室内麦粒繁殖细菌，细菌分离纯化后用LB培养基培养，热杀死后离心收集菌体，作为梨形四膜虫的食物。4.1.3摄食实验方法取处于对数生长期的梨形四膜虫用作实验种群，以活体细菌和热杀死的细菌为食进行摄食实验，实验组加入适量梨形四膜虫，为了在短时间内观察到细菌数量的明显变化，梨形四膜虫起始浓度应比较高，以未加入梨形四膜虫的活体细菌和热杀死细菌作为对照。实验温度为20℃，培养液总体积为20mL，并设置三个平行，梨形四膜虫初始密度均为250cell/mL。12h后取样，用甲醛固定(终浓度为2%)，对梨形四膜虫和细菌进行计数，以相对于对照组细菌的减少量计算梨形四膜虫摄食率。-23-\n河北大学理学硕士学位论文4.1.4摄食率的计算-1-1[57]摄食率U(bac.ciliateh)的计算：U=r/0.5Y。其中Y表示梨形四膜虫的产量，其计算公式为Y=梨形四膜虫增量/细菌的增量，表示每摄食一个细菌所产生的梨形四膜虫细胞的数量。4.2实验结果图4.3梨形四膜虫对活体细菌和热杀死细菌的摄食率Fig4.3T.priformisgrazingratesonliveandheat-killedbacteria4-1-1梨形四膜虫对活体细菌的摄食率为7.43±0.086×10bac.ciliateh，而对热杀死细菌4-1-1的摄食率为5.96±0.229×10bac.ciliateh(图4.3)。对活体细菌的摄食率是对热杀死细菌摄食率的1.25倍。4.3讨论水环境中细菌的分布并不是均一的，不同种类的细菌细胞亦有不同的形态、大小和代谢活性，这些因素都影响到原生动物对细菌的摄食率。已有报道指出：代谢活跃、生长迅速的细菌是原生动物优先摄食的对象。在可摄食粒径范围内，原生动物优先摄食个体较大且代谢活跃的细菌，回避个体较小且代谢不活跃的细菌，个体较大的细菌(0.4~0.8[58]µm)占被食菌总量的61.6±6.9%，对活细菌的摄食率高出死细菌1.83倍。本研究结果4-1-1显示：梨形四膜虫对活体细菌的摄食率为7.43±0.086×10bac·ciliateh，而对热杀死细4-1-1菌的摄食率为5.96±0.229×10bac·ciliateh，对活体细菌的摄食率是对热杀死细菌摄食-24-\n第4章细菌代谢活性对四膜虫摄食率的影响[59]率的1.25倍。原生动物能选择性摄食生长迅速的细菌，其原因可能是由于原生动物对细菌释放的化学物质具有趋化性，而代谢旺盛生长迅速的细菌可以分泌更多的化学物[60]质，如葡萄糖代谢菌比其它细菌面临更大的摄食压力，或者它们能靠细菌表面的特性来区分代谢旺盛的和代谢不旺盛的细菌，选择正在生长和正在分裂的细菌，因为此时细胞中营养更丰富。在许多环境中代谢旺盛的细菌量占总菌量的比例小，这可能不仅是食物限制引起的，也可能是较强的摄食压力引起的。失活可能是被摄食菌的一种防御策略。因此摄食可能在一定程度上调节水体细菌的丰度，调节代谢旺盛细菌占总菌量的比率。目前测定原生动物摄食率常用的方法主要包括：惰性颗粒示踪(InertParticleTracer)、荧光细菌(微藻)示踪(FLB/FLATracer)、放射性同位素示踪(RadioisotopeTracer)、新陈代谢抑制剂法(MetabolicInhibitors)等。也就是说如果用死细菌来测定原生动物摄食率，比如FLB方法、放射性标记细菌的方法，由于原生动物摄食存在选择性，因此用这些方法得到的结果低估了真正的摄食率。-25-\n河北大学理学硕士学位论文第5章用梨形四膜虫培养物降解原油实验方法初探[61,62]目前石油污染的治理方法主要有物理法、化学法及生物修复技术。生物修复方[63]法具有成本相对较低、操作简单以及无二次污染等优点。近年来，微生物对石油烃降[64-67]解的深入研究国内外已有很多报道，生物法也取得了很大的成就。国内外研究发现，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。然而，筛选步骤繁琐，一些菌种容易退化。为了克服上述问题，我们研究了原生动物纤毛虫培养物对石油的降解能力，以期寻求一种更好的降解原油的新方法。5.1材料和方法5.1.1培养基无机盐培养基：MgSO4·7H2O0.20g/L，CaCl20.02g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，KH2PO40.40g/L，Na2HPO40.02g/L，MnSO4·7H2O0.02g/L，NH4NO31.00g/L，调节pH为7.0。梨形四膜虫培养基：10.0～15.0g胰蛋白胨、1.0～3.0g葡萄糖和2.0～5.0g酵母浸粉溶于1000mL无菌蒸馏水中，并调节pH为7.0～7.5，补充10.0～20.0mg/L链霉素。5.1.2梨形四膜虫的来源、分离和纯化从环境中分离纯化纤毛虫种群：从油污染的水域或土壤中采集原生动物群落，实验室内用麦粒培养扩群，显微镜下吸取一只纤毛虫，用麦粒培养基扩大培养，获得纤毛虫的单一种群。5.1.3梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解纤毛虫种群的驯化：上述分离纯化的纤毛虫种群培养液中加0.5%原油，恒温摇床(转速200r/min，温度30℃)振荡培养，驯化3~5d。-26-\n第5章用梨形四膜虫培养物降解原油实验方法初探驯化后纤毛虫种群对原油的降解(以梨形四膜虫T.priformis为例)：实验组在无机盐培养基中加入一定量的石油，将石油浓度设置成高、中、低三个梯度，重量体积比分别为0.25%(A)、0.50%(B)、1.00%(C)，每一梯度设三到四个平行，然后加入等量(约500cell/mL)的处于对数生长期的梨形四膜虫以及等量麦粒培养的细菌，以麦粒培养的细菌作为梨形四膜虫的食物。对照组中加入等量麦粒培养的细菌作为对照，每组设三个平行。每隔12h进行取样观察，并对梨形四膜虫进行计数，观察梨形四膜虫的生长状况，绘制其种群生长曲线。培养7d后测定对照组和实验组原油含量的变化，测定原油降解率。5.1.4梨形四膜虫无菌培养物对原油的降解纤毛虫种群的驯化：上述分离纯化的纤毛虫种群进行无菌培养，无菌培养成功后，在培养液中加0.5%原油，恒温摇床(转速200r/min，温度30℃)振荡培养，驯化3-5d。驯化后纤毛虫种群对原油的降解(以梨形四膜虫T.priformis为例)：实验组在梨形四膜虫无菌培养基中加入一定量的石油，将石油浓度设置成高、中、低三个梯度，重量体积比分别为0.25%(A)、0.50%(B)、1.00%(C)，每一梯度设三到四个平行，然后加入等量(约500cell/mL)的处于对数生长期的梨形四膜虫无菌培养物。对照组中加入等量高温热杀死的梨形四膜虫无菌培养物作为对照，每组设三个平行。每隔12h进行取样观察，并对梨形四膜虫进行计数，观察梨形四膜虫的生长状况，绘制其种群生长曲线。培养7d后测定对照组和实验组原油含量的变化，测定原油降解率。5.1.5原油降解率的分析[68]原油降解率的分析：降油7d后，用紫外分光光度计法测定降解样品的残油量。由下面的公式计算降解效率：降解效率=(原油质量-剩余质量)/(降解菌的平均数量×降解天数)。标准曲线的绘制：称取0.1500g原油，根据需要称取5瓶，分别溶于15mL正己烷中，倒入25mL容量瓶中，定容，分别取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、-27-\n河北大学理学硕士学位论文22.5mL定容至25mL，待测。在波长为252nm下，用紫外分光光度计测吸光值，绘制标准曲线。5.2实验结果5.2.1梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解图5.1梨形四膜虫在不同浓度原油中的生长Fig5.1ThegrowthofT.priformisindifferentconcentrationofcrudeoil不同浓度的原油降解体系中梨形四膜虫的生长情况见图5.1。梨形四膜虫在三种浓度的原油中均能生存，原油浓度越高，梨形四膜虫的生长率越低。-28-\n第5章用梨形四膜虫培养物降解原油实验方法初探图5.2梨形四膜虫麦粒培养物对不同浓度原油的降解情况Table5.2ThedegradationofwheatgrainscultureofT.priformisindifferentconcentrationofcrudeoil降解7d后，首先肉眼观察实验结果，图5.2为实验结束后不同浓度原油的降解情况，从图中我们可以明显观察到实验组培养液相对于对照组明显浑浊。图5.3中列出了梨形四膜虫麦粒培养物对不同浓度原油的降解率。在不同浓度原油降解体系中，梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解率分别为68.08%(0.25%)、60.92%(0.5%)、37.40%(1%)，对照组中无梨形四膜虫存在，降解率分别为48.61%(0.25%)、17.62%(0.5%)、22.12%(1%)，实验组比对照组分别提高了40.05%(0.25%)、245.74%(0.5%)、69.08%(1%)。方差分析结果表明，实验组和对照组原油降解率存在显著差异(P＜0.01)。图5.3梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解率Fig5.3ThedegradationrateofwheatgrainscultureofT.priformis-29-\n河北大学理学硕士学位论文5.2.2梨形四膜虫无菌培养物对原油的降解图5.4梨形四膜虫无菌培养物对原油的降解率Fig5.4ThedegradationrateofsterilecultureofT.priformis图5.4中列出了梨形四膜虫无菌培养物对不同浓度原油的降解率。在不同浓度原油降解体系中，梨形四膜虫无菌培养物对原油的降解率分别为18.67%(0.25%)、29.84%(0.5%)。5.3讨论实验结果显示：梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解率实验组显著高于对照组(P＜0.01)，也就是当梨形四膜虫存在时显著提高了原油的降解效率，分析其原因可能为以下两点：(1)梨形四膜虫的存在能够刺激细菌的代谢活性，促进有机物质的降解效率，已[69]有研究证实：纤毛虫Colpidiumcolpoda的摄食能够增强微生物对原油的生物降解效率；(2)梨形四膜虫为食菌性原生动物，摄食方式为滤食性，在摄食细菌的过程中将原油[70]摄入体内，Andrews和Floodgate在对海洋原生动物和原油残渣之间相互作用的观察中已经发现：在原生动物中，至少是纤毛虫能够摄取石油的残渣。梨形四膜虫无菌培养物降解原油情况的结果显示：梨形四膜虫对原油存在一定程度的降解能力，但被摄食的原油在梨形四膜虫体内是否被消化利用，梨形四膜虫体内是否存在消化原油的酶，还有待进一步研究证实。目前为止还没有关于原生动物对原油消化方面的相关报道。长期以来，人们关注于石油降解细菌、真菌的筛选。筛选步骤繁琐，一些菌种容易退化。为了克服上述问题，我们研究了原生动物纤毛虫培养物对石油的降解能力，实验-30-\n第5章用梨形四膜虫培养物降解原油实验方法初探结果显示：梨形四膜虫麦粒培养物对原油的降解率分别高达68.08%(0.25%)、60.92%(0.5%)、37.40%(1%)，发现梨形四膜虫麦粒培养物对于石油具有很强的降解能力。另外，梨形四膜虫可以通过光学显微镜观察鉴定种类，分离、纯化步骤简单方便。梨形四膜虫是单细胞真核生物，在水体、土壤生态系统中数量丰富，且易于培养，如作为石油降解生物，可大大促进石油污染的治理，对生物法石油污染修复也有极大的促进作用。目前关于原生动物培养物对于石油降解的研究国内外均无报道。-31-\n河北大学理学硕士学位论文第6章梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响石油主要是由多种烃类(烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、烷烃酸类)所组成的混合物，随着社会和经济的飞速发展，石油及其制品被广泛应用于社会的各个领域。但是于此同时，石油对环境产生的污染也成为全球普遍关注的焦点问题。目前石油污染的治理方法主要有物理法、化学法及生物修复技术。生物修复方法具有成本相对较低、操作简单以及无二次污染等优点，因此微生物处理技[71]术在石油污染治理方面逐渐成为技术核心。近年来，微生物对石油烃降解的深入研究[72-76]国内外已有很多报道，生物法也取得了很大的成就。研究发现，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，其中细菌占[77][78]主导地位。然而，在土壤和水体环境以及废水处理厂中，原生动物的摄食是控制细菌丰度的一个重要因素，原生动物摄食能够影响细菌的种群大小和群落结构，那么原生动物就可能是原位生物降解速率的重要调解者。此外，在被污染处食菌性纤毛虫种群的大量出现，也引起了人们对其忍受污染物的能力和对污染物生物降解影响两方面的关注[79]。有人认为这些原生动物可能是原位生物降解活性最好的指示者。研究表明：原生动[80]物的摄食压力能够刺激细菌的代谢活性，因此食菌性原生动物在生物降解过程中具有不可忽视的潜在的作用。本文拟在鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)原油降解体系中引入梨形四膜虫(Tetrahymenapriformis)种群，研究食菌性梨形四膜虫的摄食作用对降解菌原油降解效率的影响，揭示原生动物在污染物生物降解中的潜在作用。6.1材料和方法6.1.1培养基无机盐培养基：MgSO4·7H2O0.20g/L，CaCl20.02g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，KH2PO40.40g/L，Na2HPO40.02g/L，MnSO4·7H2O0.02g/L，NH4NO31.00g/L，调节pH为7.0。梨形四膜虫培养基：10.0～15.0g胰蛋白胨、1.0～3.0g葡萄糖和2.0～5.0g酵母浸-1粉溶于1000mL无菌蒸馏水中，并调节pH为7.0～7.5，补充10.0～20.0mg.L链霉素。-32-\n第6章梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响6.1.2鲍氏不动杆菌和梨形四膜虫的来源[81]鲍氏不动杆菌从燕山石化废水处理池分离得到，经生理生化鉴定和16SrDNA序[82]列分析，鉴定为鲍氏不动杆菌(A.baumannii)。梨形四膜虫用聚氨酯泡沫塑料块(PolyurethaneFoamUnit，PFU)采自保定市东风公园池塘，实验室内分离、纯化得到单克隆种群。然后接种于梨形四膜虫(T.priformis)培养基中无菌培养。6.1.3梨形四膜虫的种群生长培养瓶(150mL)分成8个处理组，每组3个重复，每组无机盐培养液中接入等量处于对数生长期的梨形四膜虫，再接入不等量的鲍氏不动杆菌，使得降解菌/梨形四膜67777虫之间的比率依次为7.10×10，1.42×10，1.70×10，1.99×10，2.27×10，2.56×77710，2.84×10，3.55×10，培养液终体积为30mL，30℃条件下培养。每隔8h取样100μl，甲醛(终浓度2%)固定后计数梨形四膜虫。绘制梨形四膜虫在每一细菌比率处的生长曲线，并进行线性回归计算内禀生长(Intrinsicexponentialgrowthrates，μ)，内禀生长率用细菌含量来计算，并用莫诺关系进行拟合验证：μ=(μmax⋅X)/(Ks+X)，其中μmax是最大特异性生长率(Themaximumspecificgrowthrate)，Ks是半饱和含量(Thehalfsaturationconstant)。由X=[(μmax⋅X)/μ]-Ks绘图得出μ和X的最佳拟合值，从而确定μmax和Ks。然后μ的预期值通过替换上述公式中的X、μmax和Ks计算。最优加倍时间(Optimaldoublingtime,T)是由ln2/μmax得出的。梨形四膜虫细胞产量(Cellyield,Ycell)是由梨形四膜虫数量的微分增量除以细菌数量相应的减少量计算得出。因此，每个梨形四膜虫摄食的细菌的数量是通过1/Ycell计算的。细菌的最大摄取速率(Maximumuptakerateofbacteria,Umax)按μmax/Ycell计算，最大清除速率(Maximumclearancerate,Fmax)按Umax/Ks计算，体积特异性清除率(Volume-specificclearancerate,fmax)按Fmax/梨形四膜虫体积。固定后的梨形四膜虫看成是规则的椭球体，微分干涉显微镜下测量其直径计算其体积。-33-\n河北大学理学硕士学位论文6.1.4梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响驯化期：将梨形四膜虫加入到含有0.5%原油的无机盐培养基中进行驯化，并接入鲍氏不动杆菌，恒温摇床(200转/min，30℃)振荡培养，驯化期持续一周。试验期：根据毒性预实验结果，将原油浓度(质量/体积比)设置成三个梯度，分别为1%、0.5%、0.25%，实验组中加入处于对数生长期的梨形四膜虫以及鲍氏不动杆菌，对照组中仅加入鲍氏不动杆菌，根据预实验处于稳态的培养物分析确定加入的梨形四膜虫/降解菌株之间的比率，梨形四膜虫的初始浓度为130cell/mL，鲍氏不动杆菌的初始8浓度为7.50×10cell/mL，每一梯度设三个平行，培养基总体积为30mL。每隔12h进行取样，用甲醛(终浓度2%)固定，并对鲍氏不动杆菌和梨形四膜虫计数，绘制其种群生长曲线。[68]原油降解率的分析：降油7d后，用紫外分光光度计法测定降解样品的残油量。降解效率的计算公式为：降解效率=(原油质量-剩余质量)/(降解菌的平均数量×降解天数)。6.1.5残油组分的GC-MS分析取降解后的残油为样品，用GC自动进样器进样，以24mL/min进样速度注入GC-MS进行组分分析。GC-MS运行条件：色谱柱：HP-5MS，30m×250μm，膜厚0.25μm；柱温：90℃，恒温1min，以20℃/min升温至190℃，恒温1min，以10℃/min升温至270℃，停留5min；进样口温度：260℃；载气：He，流速1mL/min。分别对梨形四膜虫存在和不存在两种降解系统中降解的残油进行组分分析。-34-\n第6章梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响6.2实验结果图6.1不同细菌/梨形四膜虫比率相对应的梨形四膜虫内禀生长率(μ)Fig6.1TheintrinsicgrowthrateofT.priformiscorrespondingtothedifferentbacteria/T.priformisratio6.2.1以鲍氏不动杆菌为食的梨形四膜虫种群生长当以鲍氏不动杆菌为食时，梨形四膜虫种群生长参数列于表6.1，并用莫诺关系对生长率与降解菌数量之间的关系进行拟合验证，拟合曲线见图6.1。其最大特异性生长-17率(μ)为0.15(±0.0064)ciliatesh，与之相对应的半饱和含量(Ks)为5.65(±0.2612)×10cell/mL。表6.1以鲍氏不动杆菌为食的梨形四膜虫种群生长参数Table6.1ThepopulationgrowthparametersofT.priformisfeedingonthebacteriaA.baumannii种群参数平均值-1最大特异性生长率(μ)0.15ciliatesh7半饱和含量(Ks)5.65×10cell/mL最优加倍时间(T2)4.63h-4梨形四膜虫细胞产量(Ycell)1.31×10ciliatesperbacterium3每个梨形四膜虫摄食的细菌的数量(1/Ycell)7.66×10bacteria3-1最大摄取速率(Umax)1.15×10bacteriah-1-1最大清除速率(Fmax)20.4nlcellh2-1体积特异性清除率(fmax)1.99×10h-35-\n河北大学理学硕士学位论文6.2.2梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌种群数量的影响将梨形四膜虫种群接入到鲍氏不动杆菌原油降解系统中，鲍氏不动杆菌种群的生长情况见图6.2。当降解系统中未接入梨形四膜虫种群时，系统中鲍氏不动杆菌的平均数121313量分别为6.40×10cell/mL(1%)、2.30×10cell/mL(0.5%)、2.12×10cell/mL(0.25%)。当原油浓度为0.5%时，降解菌鲍氏不动杆菌的平均数量最高。当降解系统中接入梨形1111四膜虫种群时，鲍氏不动杆菌的平均数量分别为8.66×10cell/mL(1%)、7.14×10cell/mL12(0.5%)、4.88×10cell/mL(0.25%)。当降解系统中接入梨形四膜虫种群时，梨形四膜虫的摄食作用使鲍氏不动杆菌的数量显著降低(P＜0.01)。图6.2梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌种群数量的影响Fig6.2TheeffectsofT.priformisgrazingonthepopulationofbacteriaA.baumannii梨形四膜虫在不同浓度原油中种群生长曲线见图6.3。随着原油浓度的增加，梨形-1四膜虫种群生长受到抑制，其种群增长率分别为：0.0532±0.036h(1%)＜0.0678±0.008-1-1h(0.5%)＜0.0684±0.007h(0.25%)。方差分析结果表明，原油浓度对种群增长率具有极-36-\n第6章梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响显著的影响(P＜0.01)。图6.3不同浓度原油中梨形四膜虫的生长曲线Fig6.3ThegrowthcurveofT.priformisunderdifferentconcentrationofcrudeoil6.2.3梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响图6.4梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响Fig6.4TheeffectofT.priformisgrazingonthedegradationefficiencyofbacteriaA.baumannii降解7d后，鲍氏不动杆菌的降解效率见图6.4。当梨形四膜虫不存在时，降解效率-15-1-1-16-1-1-16-1-1分别为1.06×10g·celld(1%)、2.56×10g·celld(0.5%)、1.75×10g·celld(0.25%)。-15-1-1当梨形四膜虫存在时，降解效率分别为6.80±0.75×10g·celld(1%)、-15-1-1-15-1-12.57±0.29×10g·celld(0.5%)、2.00±0.40×10g·celld(0.25%)。当梨形四膜虫存在时，-37-\n河北大学理学硕士学位论文单个降解菌株鲍氏不动杆菌的降解效率是梨形四膜虫不存在时降解效率的6.43倍(1%)、10.05倍(0.5%)、11.40倍(0.25%)。方差分析结果表明，当梨形四膜虫存在时，鲍氏不动杆菌的降解效率显著提高(P＜0.01)。6.2.4残油组分的GC-MS分析图6.5当梨形四膜虫不存在/存在时，残油组分GC-MS分析Fig6.5GC-MSanalysisofcrudeoilafterdegradationinthepresence/absenceofT.priformis降解7d后，当梨形梨形四膜虫不存在/存在时，残油组分GC-MS分析见图6.5所示。将经不同生物处理前后的原油油成分GC-MS图谱对比分析，并结合峰的质量图谱定性，积分计算峰面积，可以得出：梨形四膜虫存在时，残油组分中短链组分增加，长链组分降低，降解程度明显加强，并且经不同生物处理前后残油组分存在很大差异，即不同生物处理方法对原油不同成分的降解程度是不同的。6.3讨论6.3.1梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌种群数量的影响当梨形四膜虫不存在时，随着原油浓度的降低，降解菌株鲍氏不动杆菌的平均数量先升高后降低。这种现象表明高浓度原油(1%)抑制了降解菌的生长，而低浓度原油在后期不能为细菌生长提供足够的碳源，导致细菌数量开始降低。当梨形四膜虫存在时，鲍氏不动杆菌的平均数量要显著低于(P＜0.01)梨形四膜虫不存在时，这种现象表明梨形四膜虫对鲍氏不动杆菌的摄食明显降低了鲍氏不动杆菌的种群大小，其对降解菌的捕-38-\n第6章梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响[83]食压力很大。Fenchel等对池塘碎屑沉积物中的细菌进行了研究，认为总细菌量中有75%被原生动物所食。由此可见，原生动物对细菌的摄食速度是惊人的，原生动物的摄食压力能够迅速降低细菌的数量。随着原油浓度的增加梨形四膜虫增长率降低，方差分析结果表明，原油浓度对种群自然增长率具有极显著的影响(P＜0.01)。这种现象一方面可能是因为高浓度原油抑制降解菌的生长，降低了作为梨形四膜虫食物的细菌的浓度，从而影响其增长，另一方面可能是因为原油对梨形四膜虫具有一定的毒害作用，原油中的烃类成分在细胞膜中积累[80]通常引起膜功能的破坏，并且最终破坏细胞的完整性。6.3.2梨形四膜虫摄食对鲍氏不动杆菌原油降解效率的影响当梨形四膜虫存在时，单个降解菌株鲍氏不动杆菌的降解效率是梨形四膜虫不存在时降解效率的6.43倍(1%)、10.05倍(0.5%)、11.40倍(0.25%)。当梨形四膜虫存在时，降解菌株鲍氏不动杆菌的降解效率显著提高(P＜0.01)。这种现象表明：尽管梨形四膜虫的摄食作用降低了降解菌株鲍氏不动杆菌的种群大小，但是食菌性梨形四膜虫的存在增强了降解菌的降解效率。原生动物的存在能够刺激细菌的代谢活性，促进有机物质的[69]降解效率。研究显示：纤毛虫Colpidiumcolpoda的摄食能够增强微生物对原油的生物[80]降解速率。Mattison和Harayama通过建立食物链模型研究鞭毛虫摄食对甲苯降解菌的降解活性影响，结果表明当食菌性鞭毛虫Heteromitaglobosa存在时，假单胞菌分解甲苯[84]14的速率显著提高。Posch等用3H标记的胸腺嘧啶核苷和用C标记的亮氨酸做示踪物，用舞行波豆虫(Bodosaltans)、瞬目膜袋虫(Cyclidiumglaucoma)和一种棕鞭藻(Ochromonassp.)作为捕食者，研究了原生动物的捕食作用对单个细菌代谢的影响，发现原生动物捕食活动可以增加细菌的代谢活力，但对于同一细菌群落，不同原生动物捕食者的影响有所不同。这些作者指出，食菌性原生动物可以刺激细菌的增长以及由于代谢分泌引起的污染性碳水化合物的降解，证明了原生动物在生物降解的过程中的潜在作用。原生动物的捕食作用能促进细菌代谢活性可能的原因如下:(1)通过摄食压力使细菌生长维持在对数生长期，防止细菌种群的衰退，提高细菌细胞内酶的活力，增加了细菌[85][86]对营养物质的利用率，(2)Seto&Tazaki指出：被Tetrahymena摄食的50%的碳能够转-39-\n河北大学理学硕士学位论文化为可溶性分泌物或者颗粒性物质。原生动物活动产生的这些溶解性有机物质可直接被细菌利用，促进细菌的生长，(3)原生动物的捕食作用减少了细菌间对营养盐和生存空间的竞争，(4)原生动物本身存在一定的降解作用，本文前期的研究也证实了这一点。[70]另外，Andrews和Floodgate在对海洋原生动物和原油残渣之间相互作用的观察中发现：在原生动物中，至少是纤毛虫能够摄取石油的残渣。被摄食的油滴在原生动物体内的命运正在进行调查，但是目前为止还没有关于原生动物对原油消化方面的相关报道。那么，除了通过摄食作用增强降解菌对原油的降解活性外，原生动物是否对原油也存在一定的降解能力，对此还有待进一步证实。6.3.3残油组分的GC-MS分析当梨形四膜虫不存在/存在时，对不同的原油组分有不同的降解能力。将经不同生物处理前后的原油油成分GC-MS图谱对比分析，并结合峰的质量图谱定性，积分计算峰面积，可以得出结论：不同生物处理方法对不同范围链长的烃类物质有不同的降解效果，混合生物的组建有利于降解更广范围的烃类物质和一些难降解的烃类组分。已有报道证[87,88]实接种混合菌种能够提高原油的降解率。食菌性原生动物在原油不同成分的生物降解过程中也具有不可忽视的潜在的作用，并且原生动物可以通过光学显微镜观察鉴定种类，分离、纯化步骤简单方便，易于培养，如作为石油降解生物同混合菌群共同作用，不同的微生物对原油不同成分有不同的降解能力，或者在降解中起到不同的作用，可大大促进石油污染的治理和原油的微生物开采，因此用不同的生物处理方法可能对石油污染控制有更好的效果。目前关于原生动物和混合菌群降解原油的研究国内外均无报道，有待进一步深入研究。-40-\n第7章结语及展望第7章结语及展望7.1全文总结本文在实验室条件下通过控制初始食物浓度和温度，研究起始食物浓度和温度对舞行波豆虫和梨形四膜虫种群动态的影响，以了解原生动物种群生长动态特征，也为探讨原生动物在水域生态系统中的作用提供参考。从实验结果看，在适宜的温度和食物浓度下，舞行波豆虫种群在进入快速增长期之前仅有一个较短的停滞期，之后种群快速增长，种群密度达到最高后迅速下降。个体相对较小的舞行波豆虫种群对环境变化能够更迅速的做出反应，条件适宜时，种群迅速暴发。梨形四膜虫为食菌性纤毛虫，在水环境中细菌数量分布并不均匀，细菌细胞亦有不同的形态、大小和代谢活性，所有这些因素都影响到原生动物对细菌的摄食率。本文通过热杀死的方法控制细菌代谢活性，研究了细菌代谢活性对其摄食率的影响。结果表明梨形四膜虫优先摄食代谢活性旺盛的细菌。为寻求一种更好的降解原油的新方法，研究了梨形四膜虫培养物对石油的降解能力，发现梨形四膜虫麦粒培养物对于石油具有很强的降解能力，分析其原因可能为以下两点：(1)梨形四膜虫的存在能够刺激细菌的代谢活性，促进有机物质的降解效率；(2)梨形四膜虫为食菌性原生动物，摄食方式为滤食性，在摄食细菌的过程中将原油摄入体内。为进一步证实原生动物摄食对细菌降解原油活性的影响，研究了食菌性梨形四膜虫的摄食作用对降解菌鲍氏不动杆菌降解原油效率的影响，结果表明：食菌性梨形四膜虫的摄食作用显著提高了降解菌鲍氏不动杆菌的原油降解效率，表明原生动物在生物降解中的潜在作用。7.2展望原生动物是微生物环中重要的成员，其食性广泛，占据重要的生态位。原生动物不仅控制浮游植物种类的大小,也通过其有选择性的摄食来控制某些藻类的生长和营养盐的重新利用，在物质循环和能量循环中扮演着重要的角色。本研究仅涉及到两种代表性原生动物梨形四膜虫和舞行波豆虫对温度和食物两种-41-\n河北大学理学硕士学位论文环境因子的反应。原生动物种类多样，其生存环境中生态因子(包括生物因子和非生物因子)众多，从整体水平上来研究环境因子对原生动物种群影响的研究尚待深入。原生动物的摄食可以影响细菌的代谢活性，本研究证实可以将原生动物的培养物应用于原油降解系统中。但原生动物培养物降解原油的机制及原生动物体内是否存在消化原油的酶类，尚待进一步证实。原生动物可以通过光学显微镜观察鉴定种类，分离、纯化步骤相对简便，且易于培养。不同的微生物对原油不同成分有不同的降解能力，或者在降解中起到不同的作用，如石油降解菌和原生动物的联合作用，可大大促进石油污染的治理和生物修复。关于应用混合生物群体降解原油的方法尚有待深入研究。-42-\n参考文献参考文献[1]BerkS.G.,ColwellR.R.,SmallE.B..Astudyoffeedingresponsestobacterialpreybyestuarineciliates[J].TransAmMicroscSoc,1976,95:514-520.[2]PickupZ.L.,PickupR.,ParryJ.D..EffectsofbacterialpreyspeciesandtheirconcentrationongrowthoftheamoebaeAcanthamoebacastellaniiandHartmannellavermiformis[J].Appl.Environ.Microbiol.,2007,73(8):2631-2634.[3]WeisseT.,StadlerP.,EvaS.Lindstrom.Interactiveeffectoftemperatureandfoodconcentrationongrowthrate:AtestcaseusingthesmallfreshwaterciliateUrotrichafarcta[J].Limnol.Oceanogr.2002,47(5):1447-1455.[4]沈韫芬,章宗涉,龚循矩,等.微型生物监测新技术[M].北京:中国建筑工业出版社.1990.[5]CaronD.A.,GoldmanJ.C.,DennettM.R..Effectsoftemperatureongrowth,resiration,andnutrientregenerationbyanomnivorousmicroflagellate[J].ApplEnvironMicrobiol,1986,52:1340-1347.[6]PedersenM.F.,HansenP.J..EffectsofhighpHonthegrowthandsurvivalofsixmarineheterotrophicprotists[J].Mar.Ecol.Prog.Ser.2003,260:33-41.[7]李凤超,辛丽君,曹卫荣,等.有机氯污染物在白洋淀PFU微型生物群落的富集[J].四川动物.2008,27(5):800-801.[8]SherrE.B.,SherrB.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