紫外分光光度法测定灵芝孢子粉多糖实验报告

'紫外分光光度法测定灵芝孢子粉多糖含量的方案实验参与人员：实验进行的时间：一实验目的建立灵芝孢子粉多糖的含量测定的方法。二操作步骤1对照品溶液的配制：取无水葡萄糖约10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，加甲醇定容，制得对照品贮备溶液。药材取样量（mg）稀释的体积（mL）浓度（mg/mL）无水葡萄糖10.0001101.00002测定波长的选择：加显色剂的空白溶液：精密称取苯酚约0.5g，用100ml蒸馏水定容。对照品溶液：密量取对照品溶液0.5ml于10ml刻度试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min即的。测定：在可见光区200—700nm内对三份溶液进行扫描，确定显色剂是否影响吸光度，确定对照品溶液的最大吸收波长。照紫外-可见分光光度法（2010版药典附录VA）测定,待测定对照品溶液的吸收光谱中显示，无水葡萄糖在与苯酚、浓硫酸显色后，在480-510nm处有明显紫外吸收，λmax=492nm，故确定测定紫外吸收的测定波长为492nm。全波长扫描结果见图1。 图1：空白、显色剂、无水葡萄糖对照品溶液显色后的全波长扫描光谱3供试品溶液的制备方法考察取灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，摇匀，精密量取50ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至150ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。4标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.10ml，0.15ml，0.20ml，0.25ml，0.3ml分别置于试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收波长处测定各溶液吸光度。以对照品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。表1标准曲线结果样品编号取用量（mL）吸光度11.00.205421.50.407932.00.617842.50.823753.00.98785方法学考察5.1精密度试验 取标准曲线项下1.5mL无水葡萄糖对照品溶液制备的样品，在最大吸收波长处连续测定吸光度6次，求出RSD。表2精密度考察样品编号吸光度A平均吸光度ASDRSD%10.40970.40180.00571.4220.405630.401140.398350.393360.40265.2稳定性试验取药材0.5g，精密称定，按供试品制备方法制备溶液，精密量取该供试品溶液0.5ml，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，在反应后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在最大吸收波长下测定吸光度,求RSD值。表3稳定性考察编号时间间隔min吸光度A平均吸光度ASDRSD%150.50220.49730.00460.942150.49823250.49544350.50065450.48916600.49845.3重复性试验取一份药材约0.5g，精密称定，分别精密量取6份供试品溶液0.5ml，供试品制备方法制备溶液，在最大吸收波长下测定吸光度，按测定数据求出多糖含量，并求算平均含量和RSD。表4重复性考察样品编号取样量g吸光度A含量mg平均含量mgSDRSD%10.50190.50125.195.200.040.7720.50230.50935.2530.50200.50535.2240.50230.50895.25 50.50250.49785.1660.50230.49765.165.4加样回收率试验精密称取同一批号的样品约0.25g，共6份，分别精密加入对照品储备液2.5ml，按照供试品制备方法制备溶液，照标准曲线制备项下的方法，依法显色，测定吸光度，按测定数据求出各自的多糖含量，并得到回收率及RSD。表5加样回收率考察编号取样量g原有量mg加入量mg吸光度A测得量mg加样回收率%平均加样回收率%SDRSD%10.25342.5952.50.50225.1946103.984101.171.861.8420.25672.5932.50.50325.2022100.1930.25862.5982.50.50645.2265101.1440.25442.5742.50.50875.2439102.7950.25552.5922.50.50125.187199.3560.25672.5992.50.50235.195399.58样品溶液的制备取灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，摇匀，精密量取50ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至150ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。测定分别精密吸取0.5ml样品溶液至试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中含多糖的含量，计算其含量，即得。表6不同产地灵芝孢子粉样品的多糖含量药材批次编号取用量g取样体积（mL）吸光度A含量mg多糖总含量（%）平均含量（%）SDRSD%大丰10.50270.500.63306.191.241.240.010.0820.50280.500.63426.191.2430.50260.500.63406.191.24吉林长春10.50160.500.49495.141.031.020.010.3520.50130.500.49025.101.0230.50190.500.49245.121.02亳州10.50140.500.56935.701.141.140.010.1420.50160.500.57095.711.1430.50120.500.56895.701.14 山东济宁10.50300.500.86337.931.591.590.010.3120.50290.500.86047.911.5830.50280.500.86687.961.59山东春江10.50160.500.50535.221.041.040.010.0320.50200.500.50575.221.0430.50240.500.50535.221.04金寨10.50280.500.99198.901.781.780.010.0520.50320.500.99298.911.7830.50300.500.99288.911.78霍山一品堂10.50150.250.564511.332.272.280.010.5520.50150.250.570511.422.2830.50160.250.572511.452.29安徽10.50010.100.763935.887.187.170.010.0620.50020.100.763035.857.1730.50020.100.762935.857.17'