紫外分光光度法研究维生素c的稳定性及蔬果和果汁中含量的测定

'分类号：R155.5学校代码：10114密级：学号：2012200905硕士学位论文紫外分光光度法研究维生素C的稳定性及蔬果和果汁中含量的测定StudythestabilityofVitaminCbyultravioletspectrophotometryanddeterminationofthecontentsinseveralkindsoffruits,vegetablesandjuices研究生：王海佳指导教师：张加玲教授专业名称：公共卫生硕士研究方向：卫生检验学位类型：专业学位所在学院：公共卫生学院中国山西二〇一五年五月二十日 分类号：R155.5学校代码：10114密级：学号：2012200905紫外分光光度法研究维生素C的稳定性及蔬果和果汁中含量的测定StudythestabilityofVitaminCbyultravioletspectrophotometryanddeterminationofthecontentsinseveralkindsoffruits,vegetablesandjuices研究生：王海佳指导教师：张加玲教授专业名称：公共卫生硕士研究方向：卫生检验学位类型：专业学位所在学院：公共卫生学院中国山西二〇一五年五月二十日 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师张加玲指导下，本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：1、交回学校授予的学位证书；2、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉；4、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：日期：年月日指导教师签名：日期：年月日（本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用） 目录中文摘要................................................................................................................................I英文摘要..............................................................................................................................IV前言....................................................................................................................................11概述..............................................................................................................................12维生素C的生理作用....................................................................................................23维生素C检测方法的研究现状.....................................................................................34研究内容..........................................................................................................................5第一部分维生素C标准溶液的稳定性研究...................................................................61材料与方法......................................................................................................................61.1主要仪器与试剂.........................................................................................................61.2溶液配制.....................................................................................................................71.3实验方法.....................................................................................................................72结果..............................................................................................................................82.1介质溶液对维生素C标准溶液稳定性的影响的研究............................................82.2存放条件对维生素C标准溶液稳定性的影响......................................................142.3不同浓度维生素C（0.5mol/LNaCl）溶液的稳定时间......................................163讨论............................................................................................................................184结论............................................................................................................................19第二部分果蔬中维生素C含量的测定.........................................................................201材料与方法....................................................................................................................201.1主要仪器...................................................................................................................201.2主要试剂...................................................................................................................201.3标准溶液配制...........................................................................................................211.4样品的采集、制备与测定.......................................................................................211.5结果计算...................................................................................................................222结果............................................................................................................................23 2.1实验条件选择...........................................................................................................232.2标准曲线及线性范围...............................................................................................252.3方法检出限...............................................................................................................252.4精密度实验...............................................................................................................262.5准确度实验...............................................................................................................262.6样品的测定...............................................................................................................263讨论............................................................................................................................284结论............................................................................................................................29第三部分果汁中维生素C稳定性的研究.....................................................................301材料与方法....................................................................................................................301.1主要仪器...................................................................................................................301.2主要试剂...................................................................................................................301.3样品的采集、制备与测定.......................................................................................301.4结果计算...................................................................................................................312结果............................................................................................................................322.1果汁的稳定性...........................................................................................................322.2橙汁加入食用盐后的稳定性...................................................................................322.3橙汁及果粒橙稀释后的稳定性...............................................................................332.4光照与温度对鲜榨橘汁维生素C稳定性的影响..................................................342.5鲜榨橘汁暴露在空气中的面积对维生素C稳定性的影响..................................353讨论............................................................................................................................364结论............................................................................................................................37参考文献..............................................................................................................................38综述..................................................................................................................................421蔬果中维生素C的稳定性研究...................................................................................422维生素C的检测方法...................................................................................................442.1滴定分析法...............................................................................................................442.2分光光度法...............................................................................................................442.3荧光法.......................................................................................................................45 2.4电化学法...................................................................................................................452.5毛细管电泳法...........................................................................................................462.6高效液相色谱法.......................................................................................................46致谢..................................................................................................................................50在学期间承担/参与的科研课题与研究成果....................................................................51个人简介..............................................................................................................................52 紫外分光光度法研究维生素C的稳定性及蔬果和果汁中含量的测定摘要目的：维生素C（VitaminC）又叫L-抗坏血酸（AscorbicAcid，AA），是一种水溶性维生素，常态下不稳定，容易被氧气、金属离子，如Cu2+、Fe3+氧化，也易受温度、pH、光照等的影响。系统研究前述各种因素对维生素C标准溶液的稳定性影响，对于维生素C标准溶液的保存、果蔬样品中维生素C的提取和准确测定、以及果蔬中维生素C的稳定性都具有重要意义。研究提高维生素C标准溶液的稳定性的溶剂介质；建立准确、快速地测定果蔬维生素C含量的紫外分光光度法，并用于果蔬中维生素C的测定和果汁中维生素C随时间变化的研究，以引导人们有效地利用维生素C。方法：1.维生素C标准溶液（10µg/ml）的稳定性研究：对维生素C标准溶液在不同介质中的稳定性进行研究，包括NaCl及其不同浓度、食盐及其不同浓度、乙酸及其不同浓度、食醋、自来水，对光照、温度、空气暴露条件下的稳定性进行研究。2.果蔬样品维生素C含量的测定：基于维生素C的水溶液在紫外区265nm波长处有最大吸收峰，利用Cu2+氧化消除背景干扰，用紫外分光光度法进行测定，并对反应条件进行优化选择，对西红柿、橙子等7种果蔬中的维生素C含量进行测定。3.果汁维生素C稳定性的研究：研究鲜榨及市售果汁中维生素C在不同条件下随时间的变化情况。结果：1.维生素C标准溶液（10µg/ml）的稳定性：按吸光度值改变≥5%视为维生素I C浓度有变化，结果如下：⑴维生素C的蒸馏水溶液不稳定，吸光度在2h减小30%，7h变为0；在0.5mol/LNaCl溶液中可以延长其稳定时间，8h内吸光度基本不变；维生素C在自来水中最不稳定，3h全部被氧化；⑵食盐可提高维生素C的稳定性，且随着食盐浓度的升高，其稳定性提高。其中，维生素C在0.5mol/L的食盐中可稳定3h；0.25mol/L稳定2h；0.05mol/L稳定1h；⑶维生素C的0.05mol/LHAc溶液可稳定3h；0.001mol/L陈醋可稳定1h；⑷4℃冷藏避光条件下，维生素C的损失量最小，9h吸光度只减小1.4%，常温见光和常温避光保存下，7h减小约4%；空气对维生素C的氧化作用较弱；⑸随着维生素C标准溶液浓度的减小，其稳定时间也减短。以0.5mol/LNaCl溶液为溶剂，10µg/ml维生素C溶液可放置9h；40µg/ml可放置3d；1000µg/ml放置7d。2.紫外分光光度法测定维生素C最佳实验条件的选择，及对7种常见水果、蔬菜维生素C含量的测定：⑴果蔬用0.5mol/LNaCl溶液，按液料比为6：1提取维生素C，以Cu2+为破坏剂扣除基体的空白值，利用紫外分光光度法进行测定，在1.0~15.0µg/ml浓度范围内，线性关系良好，r＞0.999，RSD在0.92%~5.66%之间，回收率在88.7%~103.6%之间；⑵7种蔬果维生素C含量差别较大，其中猕猴桃含量最大，为147.75mg/100g，白菜含量低于方法检测限（0.062µg/ml）。同种蔬果不同品种维生素C含量有差别，如两种圣女果维生素C含量分别为25.25mg/100g和32.49mg/100g，经t检验，t=-17.94，P＜0.05，差别有统计学意义；猕猴桃维生素C含量分别为147.75mg/100g和49.25mg/100g，相差近3倍。3.果汁样品维生素C的稳定性：稀释对果汁中维生素C的保存最为不利，同时随时间的延长、温度的升高，保存率减小。结论：1.用0.5mol/LNaCl溶液为溶剂配制维生素C标准溶液，可延长维生素C的稳定时间，1000µg/ml标准储备液4℃冷藏避光保存可达7d；II 2.紫外分光光度法测定蔬菜水果中维生素C含量的方法简便快速，灵敏度高，结果准确可靠；3.果汁应原汁、低温保存，且尽快食用，以避免维生素C的损失。关键词：分光光度法;维生素C;稳定性;果蔬;果汁III StudythestabilityofVitaminCbyultravioletspectrophotometryanddeterminationofthecontentsinseveralkindsoffruits,vegetablesandjuicesAbstractObjective:VitaminC(alsoknownasascorbicacid,AA)isawatersolublevitamin.Itislessstableamongthevitaminsandisverysensitivetolight,heat,metalionandair.VitaminCisverysensitivetolight,heat,metalionandair.TostudythesefactorsonvitaminC’sstabilityissignificanceforpreservationofvitaminCstandardsolution,itsextractionfromvegetablesandfruitsanditsdeterminationaccurately.ThepurposeofthisstudywastoresearchthesolventmediumwhichcanenhancethestabilityofvitaminCandtoestablishanaccurate,rapidultravioletspectrophotometrymethodtodeterminatevitaminCinfruitsandvegetables.Then,themethodwillbeappliedtodetectthecontentofvitaminCinvariousfruitsandtostudythedegradationofvitaminCinfruitjuices,whichresultswillprovideusefulinformationtoleadpeopletogetthemostvitaminCfromfood.Methods:1.ThestudyofvitaminC’sstability:ToexplorethestabilityofvitaminCindifferentsolventmediums,suchasNaClaqueoussolution,saltaqueoussolution,aceticacidaqueoussolution,vinegarandtapwater.Todetecthowthefactorssuchaslight,heatandairaffectthestabilityofvitaminC.2.TheestablishmentofthedeterminationmethodofvitaminCinfoods:ThevitaminChasabsorptionpeakat265nm,withcopperionoxidizingvitaminC,theultravioletspectrophotometrymethodhasbeenestablished.AndthecontentofvitaminCin7differentsfruitsandvegetablesweredetermined.3.ThestudyofvitaminC’sstabilityinjuices:ToresearchthechangeofthecontentofvitaminCinfreshfruitjuicesandmarketjuiceswithtimeinvariousconditions.IV Results:1.ThestabilityofvitaminC:Whenthechangeofabsorbanceat265nmismorethan5%,itisconsideredtheconcentrationofvitaminChaschanged.Theresultsasfollows:⑴VitaminC(10µg/ml)indistilledwaterisinstable,theabsorbancedecrease30%intwohours,andreducedtozerowithin7hours;Butin0.5mol/LNaClsolution,ithasgoodstabilityandcankeep8hours;VitaminCintapwaterisunstable,theabsorbancedecreasetozerowithin3hours;⑵Withthedecreaseoftheconcentrationofsalt,thestabilityofvitaminCreduced.In0.5mol/Lsaltsolution,itcanpreserve3hours,in0.25mol/Lcankeep2hoursandin0.05mol/Lcanconserve1hour;⑶VitaminCin0.05mol/Laceticacidsolutioncansave3hoursandin0.001mol/Lmaturevinegarcankeep1hour;⑷Intheconditionof4℃refrigeratorandprotectedfromlight,thelossvitaminCisminimum,theabsorbanceonlydecrease1.4%inninehours,butinroomtemperature,itdecreaseabout4%in7hours.TheeffectofairtovitaminCislittle;⑸WiththedecreaseoftheconcentrationofvitaminC,thestabletimelower:10µg/mlvitaminCcankeep9hours,40µg/mlcanconserve3days,1000µg/mlcanhold7days.2.ScreeningoftheoptimumexperimentconditionsofultravioletspectrophotometryanddeterminationofvitaminC’scontentinsevenkindsoffruitsandvegetables.⑴VitaminCinfruitsandvegetableswereextractedby0.5mol/LNaClwiththeliquid-solidratioof6:1,usedCu2+oxidationitanddeterminationofthecontentsbyultravioletspectrophotometry,intherangefrom1.0to15.0μg/ml,theworkingcurvehadagoodlinearcorrelation,withcorrelationcoefficientr>0.999,andtherecoverywas88.7%~103.6%,RSDwas0.92%~5.66%;⑵ThecontentofvitaminCinsevenkindsofvegetablesandfruitsaredifferents,thecontentinkiwiislargestwith147.75mg/100g,andthevitaminC’scontentincabbageislowerthanthedetectionlimit.Besides,thesamefruitsorvegetableswithdifferentvarietieshavedifferentcontents:twokindsoftomatoes’vitaminCcontentwere25.25mg/100gand32.49mg/100g;twokindsofkiwiwere147.75mg/100gand49.25mg/100g.3.ThestabilityofvitaminCinjuices:DilutionismostharmfultovitaminCinjuices,V meanwhile,withthetimeextendedandtemperaturerised,thesurvivalratedecreased.Conclusions:⑴Throughthestudy,wefoundthat0.5mol/LNaClcanprolongthestabletimeofvitaminC.Andundertheconditionof4℃andplacedawayfromlight,1000µg/mlvitaminCcanhold7days;⑵ThemethodestablishedtodeterminationofvitaminCinfruitsandvegetablesissensitive,accurate,simpleandrapid;⑶Juiceshouldbekeptinoriginalandsavedunderlowtemperature,andshouldbedrankassoonaspossible,forthevitaminC’scontentishigher.Keywords:Spectrophotometry;VitaminC;Stability;FruitsandVegetables;JuiceVI 山西医科大学硕士学位论文前言1概述维生素C（VitaminC）又叫L-抗坏血酸（AscorbicAcid，AA），空间结构如图1。易溶于水，在乙醇中溶解度较小，不溶于氯仿、苯、乙醚、石油醚、油脂等有机溶剂[1]，具有酸性和还原性，有4种异构体，即L-抗坏血酸，D-抗坏血酸，L-异抗坏血酸，D-异抗坏血酸，分子结构如图2所示。图1维生素C的空间结构图2维生素C的分子结构水果和蔬菜中维生素C含量丰富，主要的存在形式是L-抗坏血酸，其功效最强，即是通常所指的抗坏血酸。本文所研究的维生素C也即L-抗坏血酸。一定的条件下，抗坏血酸可被氧化，生成脱氢抗坏血酸，L-脱氢抗坏血酸在生物体内还可被还原，转变为L-抗坏血酸，这种变化可逆，故L-脱氢抗坏血酸仍具有生物活性。但脱氢抗坏血酸进一步被氧化生成二酮古洛糖酸时，其活性消失，这个过程不可逆。1 山西医科大学硕士学位论文2维生素C的生理作用众所周知，维生素C是人体需要量最大的一种维生素，正常成人体内约含维生素C1500mg，最高可达3000mg[2]，它对维持人体生理机能意义重大。维生素C在人体氧化还原代谢反应中起调节作用，主要生理功能有：促进胶原蛋白及结缔组织的合成，促进伤口愈合[3]；作为高效抗氧化剂，清除体内的活性氧基团及一些自由基，以保护细胞免遭氧化损害[4]；增强免疫功能[5]；预防癌症[6]；促进机体对铁的吸收[7]等。尽管维生素C对人体很重要，但人体对它的需求量是一定的，太多或太少都不利于人体，严重时还会引起病变反应[8]。例如，缺乏维生素C可引起造血机制障碍，容易出现牙龈萎缩、出血、严重时还可引起胃、肠道、鼻、肾脏及骨膜下面出血等坏血病症状[9]；但维生素C过量摄入，也对人体不利，临床观察和动物实验已证明，过量服用维生素C可能引起腹泻、皮疹、胃酸过多、胃液反流、血管内溶血或凝血、草酸及尿酸结石、加快动脉硬化等，儿童过量服用后还易患骨病[10-11]。因此人们在通过天然食物或强化食品及药物补充维生素C时，应注意科学用量。《中国居民膳食营养素参考摄入量》（2013版）提供了不同人群每日维生素C摄入量的RNI（推荐摄入量）或AI（适宜摄入量）[12]，0、0.5、1、4、7、11、14岁以上儿童及成人分别为40、50、60、70、80、90和100mg/d。特殊人群中，孕早期妇女每日摄入标准为100mg/d，孕中期、孕晚期及哺乳期妇女为130mg/d。但是，由于人体缺乏古洛糖内酯氧化酶，不能自身合成维生素C[13]，必须从食物中获取。水果和蔬菜含有丰富的维生素C[14]，人体所需98％的维生素C都来源于水果和蔬菜[15]。因而，果蔬中维生素C含量的高低不仅是评价其营养价值的重要指标之一，也是人们根据营养需求，合理选择，科学搭配果蔬的依据。由于维生素C的水溶液在常态下不稳定，容易被O[16][17]2氧化，易受温度、pH值、H[18][19][20-21]2O2、铜离子、铁离子、光照等的影响，研究维生素C在上述各种条件下的稳定性，了解果蔬贮存和加工过程中其含量的变化尤为重要，对于指导人们合理储藏，最大限度的利用维生素C具有重要意义。2 山西医科大学硕士学位论文3维生素C检测方法的研究现状目前，食品中维生素C的测定方法很多，主要包括国标法——荧光法和2，4-二硝基苯肼比色法，还有2，6-二氯靛酚滴定法、碘量法、高效液相色谱法、紫外分光光度法、电化学法、毛细管电泳法、流动注射化学发光法等。2，6-二氯靛酚滴定法是国标GB/T6195-1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法》的方法，其原理是：2，6-二氯酚靛酚染料可将还原型抗坏血酸氧化为脱氢型；该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变为无色[22]。因此，用2，6-二氯酚靛酚滴定含有维生素C的酸性溶液时，当到达滴定终点时，染料被还原为无色，剩余的染料则表现为浅红色，可以根据染料消耗量计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。该法简便易行，但是由于许多果蔬都含有色素物质，其维生素C提取液通常有颜色，滴定终点不易辨认。所以，此类方法对浅色果蔬测定结果比较可靠，但不适于深色果蔬的测定[23]。荧光法是国标GB/T5009.86-2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法》推荐的第一法，是先用偏磷酸-乙酸溶液提取样品中的维生素C，然后用活性炭将其氧化，再在乙酸钠的溶液中与邻苯二胺缩反应，合成具有蓝色荧光的喹喔啉，于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度，其荧光强度与维生素C的浓度呈正比[24]。该方法简便，灵敏度和准确度高，重现性好，但是操作较为繁琐，且当样品中存在丙酮酸时，亦可以与邻苯二胺反应产生荧光物质，造成干扰。2，4-二硝基苯肼比色法是GB/T5009.86-2003推荐的第二法，其原理是在维生素C的草酸溶液中加入活性炭，使其氧化成脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼反应生成红色的脎，进行比色定量[24]。该方法简单易行，成本较低，但干扰较多。若溶液中存在丙酮酸，也可与其反应生成脎；若待测溶液本身有颜色，也会影响测定。直接碘量法是我国药典中的测定抗坏血酸含量的一种标准方法[25]。是根据碘可定量氧化维生素C而直接进行滴定的[26]。此法也可以用于水果、蔬菜中维生素C含量的测定[27]。具有变色敏锐、简便、易行、准确度高的优点，但不适宜低含量的样品的测定。随着高效液相色谱(HPLC)的日益普及，应用HPLC测定维生素C是目前最常用的分析方法之一。它可以选择不同的色谱柱及流动相，使待检测物质和其他共存成分3 山西医科大学硕士学位论文实现分离。此方法不仅分离分析速度快，仅需几分钟或十几分钟，而且可选用紫外、荧光、电化学及质谱等各种高灵敏度检测器，检测组分含量低至10-9~10-10g/ml。此法对多种维生素的同时测定更具有优势[28]，但缺点是所用仪器较为昂贵，使用费用较高[29]。毛细管电泳法是一种测定维生素C含量的新方法，具有高效、快速、简便等优点。杨建洲等[30]采用该方法，利用紫外检测器对果蔬中的维生素C进行了测定，结果满意。紫外分光光度法是利用维生素C的水溶液在紫外区265nm有吸收而建立的一种方法。由于水果、蔬菜中共存成分复杂，有些成分可能在265nm处也有吸收，因此需扣除干扰物质所产生的吸光值。目前报道校正基体干扰的方法主要有两种，一是用碱溶液破坏抗坏血酸[31-32]，二是用金属离子氧化抗坏血酸[33-34]，再利用两次吸光度的差值测定维生素C的含量。此法操作简单、快速、准确、廉价，也适于有色样品的测定，具有广泛的使用价值。电化学分析法是直接利用电信号的变化对物质进行测定的，根据所测量电学量的不同，分为电导分析法[35]、库仑滴定法[36]、伏安法[37]、极谱分析法[38]。与其它检测法相比，该法所需仪器设备简单、易自动化、便于携带、灵敏度和准确度均较高、选择性好。4 山西医科大学硕士学位论文4研究内容随着人们对健康的重视，对食物的营养成分也更加关注。已有研究表明维生素C的水溶液不稳定，对光和温度敏感，但对于维生素C本身及其在果蔬中受氧气、温度、酸度、金属离子等各种条件影响的系统研究少见报导，因此本文将进行以下研究：⑴维生素C标准溶液稳定性的研究研究维生素C标准溶液在不同介质中的稳定性；研究在光照、温度、空气暴露条件下的稳定性，以进一步完善对于维生素C的认识。这对维生素C标准溶液的保存、蔬果样品维生素C含量的准确测定具有重要意义。⑵利用紫外分光光度法测定果蔬中维生素C的含量采用紫外分光光度法，通过对溶液介质及其测定波长、酸度、破坏剂等测量条件的选择，确定最佳实验条件，以获得高的测量灵敏度和准确度，并对多种水果、蔬菜中的维生素C含量进行测定。对人们进行日常蔬果的选择具有实际应用价值。⑶果汁维生素C稳定性的研究对日常生活中人们常用的榨汁机榨出的果汁及市售果汁中维生素C的含量随时间及存放条件的变化进行研究，以指导人们科学饮用，更好的利用果蔬中的维生素C。5 山西医科大学硕士学位论文第一部分维生素C标准溶液的稳定性研究维生素C分子中存在烯二醇结构，其水溶液不稳定[16]，容易被O[17]2氧化，易受温度[18]、pH值、铜离子、铁离子[19]、光照[20-21]等的影响。系统研究这些影响因素对维生素C标准溶液的保存、果蔬样品中维生素C的提取、以及利用该标准溶液测定样品中的维生素C含量的准确性都具有重要意义。维生素C在酸性溶液中相对较稳定，多数文献采用的溶剂是各种酸性溶液，如草酸、乙酸、偏磷酸及偏磷酸-乙酸混合液等。但对于维生素C溶液的稳定时间各不相同，也不很明确，大多只是提及了要迅速操作，部分文献只对1~2h内的稳定性进行了研究。如，赵连俊[39]用新煮沸并冷却的蒸馏水为溶剂配制维生素C标准溶液，10min吸光度减小10%，2h减小20%。张立科等[40]采用偏磷酸和乙酸(体积比为3：7)混酸溶液配制维生素C溶液，必须在90min内进行测定才具有较好的稳定性，否则定量结果准确度受到影响。可见，上述方法配制出的维生素C标准溶液分解现象严重，因此，有必要对维生素C标准溶液的配制方法进行研究和改进，以提高维生素C的稳定性，这对定量测定的准确度尤为重要。1材料与方法1.1主要仪器与试剂Lambda35紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司，1cm石英比色皿)；中佳SC-2556低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；TG328A型电光分析天平(上海天平仪器厂)；雷磁PHS-3C型精密pH计；YD-1-4圆形电热板（江苏省东台县电器厂）。L-抗坏血酸（分析纯，含量≥99.7%）；氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸铜（分析纯）；磷酸、乙酸、乙酸钠（分析纯）；6 山西医科大学硕士学位论文乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.02mol/L，pH=4.70）；乙醇（分析纯）；食盐、陈醋、白醋（购自超市）；实验用水均为蒸馏水，电导率≤2μS/cm。1.2溶液配制1000µg/ml的维生素C标准储备液：用分析天平准确称取抗坏血酸0.0500g置于50ml容量瓶，用不同的介质溶液（详见后）溶解后稀释至刻度，摇匀。置于4℃冰箱，冷藏避光保存。10µg/ml的标准应用液：准确吸取2.00ml维生素C标准储备溶液，用相应的溶剂稀释至50ml得到40µg/ml的标准中间液，再吸取25.00ml维生素C中间溶液，用相应的溶剂稀释至100ml配制而成。1.3实验方法采用紫外分光光度法检测维生素C。首先，量取适量新配制好的维生素C标准应用液立即进行检测，由此得到的首次吸光度值A0认为是维生素C的原始浓度，记为100％；然后分别检测维生素C标准应用液在不同的时间间隔内的吸光度值，将这些吸光度与A0进行比较，得到不同时间段吸光度变化百分比。以时间为横坐标，吸光度百分比为纵坐标，绘制维生素C标准应用液的稳定性曲线。7 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1介质溶液对维生素C标准溶液稳定性的影响的研究2.1.1不同酸介质的选择酸性环境中，维生素C的最大吸收波长为243nm，在此波长处，草酸溶液有非常强的吸收，不能作为紫外测定维生素C时的溶剂；乙酸和磷酸有微弱的吸收，可通过扣除其空白值，计算出样品吸光值，可作为酸溶剂。2.1.2不同介质溶液对维生素C稳定性的影响将蒸馏水配制的维生素C标准储备液分别用蒸馏水、0.25mol/LKCl溶液、0.25mol/LNaCl溶液、0.25mol/LNa2SO4溶液、1+1无水乙醇-蒸馏水、1+9无水乙醇-蒸馏水和0.05mol/LH3PO4溶液逐级稀释，配成10µg/ml标准应用液（常温放置），测定其稳定性，结果见图1-1。图1-1维生素C应用液在不同介质中的稳定性由图可以看出：维生素C的水溶液很不稳定，吸光度在2h减小30%，7h变为0；维生素C的0.25mol/LNaCl和KCl溶液稳定性最好，吸光度随时间变化最小，6h内基本不变，7h开始有变化，吸光度值减小2.0%，20h减小10%；1+1乙醇-蒸馏水溶液2h减小1.8%，4h减小5.0%；1+9乙醇-蒸馏水溶液2h内减小4.9%；0.05mol/L磷酸溶液2h内减小12%，20h变为0；0.25mol/LNa2SO4溶液2h减小8 山西医科大学硕士学位论文40%，7h变为0。以吸光度值减小≥5%视为其有变化，可得出:⑴维生素C的水溶液很不稳定。维生素C在水中快速分解，2h减小30%，7h全部分解；⑵维生素C的NaCl、KCl溶液较稳定，即NaCl和KCl对维生素C有保护作用，可以使其稳定时间延长，6h内都基本不变；⑶Na2SO4溶液对于维生素C的稳定性没有保护作用；⑷乙酸及乙醇溶液对维生素C有一定的保护作用，但效果不如NaCl和KCl。本实验选择NaCl溶液作为维生素C的溶剂。2.1.3不同浓度的NaCl溶液对维生素C稳定性的影响用不同浓度的NaCl溶液配制标准储备液，并逐级稀释成10µg/ml标准应用液（常温放置）进行测定，观察其稳定时间，见图1-2。图1-2不同浓度NaCl对维生素C的稳定影响由图可知：随着NaCl浓度的升高，维生素C溶液的稳定性提高。其中，维生素C的0.5mol/LNaCl的溶液的吸光度在8h内基本不变，9h开始稍有变化，减小1.6%，即维生素C的0.5mol/LNaCl溶液可稳定9h；0.25mol/LNaCl溶液的吸光度在5h内基本不变，6h开始有变化，9h减小5.1%，即0.25mol/LNaCl溶液稳定时间不超过9h；0.125mol/LNaCl溶液吸光度在5h内减小4.3%，即0.125mol/LNaCl溶液可稳定5h；0.05mol/L、0.025mol/LNaCl溶液吸光度在2h内分别减小7.8%和8.7%，即它们的稳定时间不超过2h。9 山西医科大学硕士学位论文本实验采用0.5mol/LNaCl溶液作为维生素C的稳定剂。2.1.4不同食盐浓度对维生素C稳定性的影响NaCl溶液对维生素C有保护作用，可以延长其稳定时间，本实验用食用盐（NaCl≥99.1%）代替NaCl（NaCl≥99.5%），观察食用盐对维生素C的作用情况，以应用于实际生活。用不同浓度的食盐溶液配制维生素C标准溶液，观察其稳定性，结果如图1-3。图1-3不同食盐浓度对维生素C的稳定影响由图可看出：与水相比，食盐可以提高维生素C的稳定性。随着食盐浓度的增加，维生素C的稳定性提高。其中，维生素C的水溶液吸光度在2h内减小30%，7h变为0；0.05mol/L食盐溶液吸光度在2h内减小10%；0.25mol/L食盐溶液吸光度在3h内减小6.4%；维生素C的0.5mol/L食盐溶液吸光度在3h内减小5%。2.1.5食盐与NaCl（0.5mol/L）对维生素C稳定性的比较10 山西医科大学硕士学位论文图1-4NaCl与食盐对维生素C稳定性的对比将0.5mol/LNaCl与0.5mol/L食盐溶液对维生素C溶液稳定性进行比较，如图1-4所示，可以看出虽然食盐可以延长维生素C的稳定时间，但其稳定性不如NaCl溶液，其原因可能是食用盐中含有的其他共存物质，如碘酸钾等，可使维生素C氧化。2.1.6不同浓度乙酸对维生素C稳定性的影响分别用0.1、0.05和0.01mol/L的乙酸溶液为介质配制维生素C标准储备液，并用相应浓度的乙酸将储备液逐级稀释，配成10µg/ml标准应用液（常温放置）。于注243nm处进行测定，观察维生素C标准应用液的稳定时间，结果见图1-5。注：在紫外区对维生素C的乙酸溶液进行扫描，其在酸性条件下最大吸收波长为243nm。图1-5不同浓度HAc对维生素C的稳定时间（λ=243nm）从图可得到：与水相比，乙酸可以明显延长维生素C的稳定时间。0.1mol/L和11 山西医科大学硕士学位论文0.05mol/LHAc溶液对维生素C的稳定效果差别不大，3h都减小3%；0.01mol/LHAc溶液3h减小6%。2.1.7NaCl（0.5mol/L）与HAc（0.05mol/L）对维生素C稳定性的比较图1-60.5mol/LNaCl与0.05mol/LHAc对维生素C稳定性的对比将0.5mol/LNaCl（λ=265nm）与0.05mol/LHAc（λ=243nm）对维生素C溶液稳定性进行比较，如图1-6所示，可以看出，NaCl溶液比乙酸对维生素C的稳定效果更好。2.1.8陈醋和白醋对维生素C稳定性的影响乙酸溶液对维生素C的水溶液有保护作用，可以延长其稳定时间，本实验用食醋（总酸≥3.50g/100ml）代替乙酸，观察食醋对维生素C的作用，以求应用于实际生活。以陈醋和白醋为溶剂配制维生素C标准溶液时，由于食醋成分复杂，且陈醋颜色较深，测定空白值高，结果不准确，因此对其进行稀释。当以0.003mol/L的食醋和白醋为溶剂时，陈醋的本底仍然很高，继续稀释，直至稀释至0.001mol/L，对维生素C标准溶液进行测定（λ=247nm），结果如图1-7。12 山西医科大学硕士学位论文图1-7陈醋和白醋对维生素C稳定性的影响从图中可以看出，白醋在提高维生素C稳定性方面几乎没有作用，陈醋对维生素C有一定的保护作用，但效果不如0.05mol/LHAc好。2.1.9自来水对维生素C稳定性的影响日常生活中人们食用的水均为自来水而非蒸馏水，本实验用自来水及自来水配制的0.5mol/LNaCl和0.5mol/L食盐溶液配制维生素C标准储备液，并用相应介质溶液逐级稀释，配成10µg/ml标准应用液（常温放置），观察自来水对维生素C稳定性的影响，结果如图1-8。图1-8自来水对维生素C的稳定时间由图可知，维生素C在自来水中很不稳定，1h吸光度减小62%，3h全部被氧化，吸光度降为0。其原因是自来水成分复杂，某些成分可加快维生素C的氧化损失。加入0.5mol/LNaCl，可以大大提高其稳定性，3h仅减小35%，食盐的作用略13 山西医科大学硕士学位论文次于NaCl，3h吸光度减小38%，与蒸馏水为介质的基本相当。2.2存放条件对维生素C标准溶液稳定性的影响2.2.1光照与温度对维生素C稳定性的影响用蒸馏水、0.5mol/LNaCl、0.5mol/L食盐、0.05mol/LHAc溶液配制维生素C标准储备液，并用相应介质溶液将储备液逐级稀释，配成10µg/ml标准应用液，分别放置在常温（20℃）见光、常温避光和冷藏（4℃）避光处，测定其随时间的变化，结果如图1-9~1-12。图1-9维生素C的水溶液在不同条件下的稳定性图1-10维生素C的0.5mol/LNaCl溶液在不同条件下的稳定性14 山西医科大学硕士学位论文图1-11维生素C的0.5mol/L食盐溶液在不同条件下的稳图1-12维生素C的0.05mol/LHAc溶液在不同条件下的稳定性由图1-9、1-10、1-11、1-12可看出，维生素C溶液在相同溶剂中，常温见光和常温避光保存下的损失差别不大，而冷藏避光保存的损失要小一些，说明冷藏避光有利于维生素C的保存。图1-9可得到，维生素C的水溶液冷藏避光保存下，2h吸光度减小12%，9h减小75%，24h全部被氧化，吸光度降为0。常温见光和常温避光保存下，2h吸光度减小35%左右，7h降为0。由图1-10可知，维生素C的NaCl溶液冷藏避光保存下，7h基本不变，9h开始有变化，吸光度减小1.4%，24h减小10%。常温见光和常温避光保存下，5h吸光度基本不变，7h减小4%左右，24h常温避光和常温见光分别减小14%和18%。图1-11可看出，维生素C的食盐溶液冷藏避光保存下，2h吸光度减小2.2%，915 山西医科大学硕士学位论文h减小9%，24h减小15%。常温见光和常温避光保存下，2h吸光减小4.5%左右，9h减小18%左右，24h常温避光和常温见光分别减小46%和50%。由图1-12可得到，维生素C的乙酸溶液冷藏避光保存下，2h吸光度减小1.2%，9h减小10%，24h减小20%。常温避光和常温见光保存下，2h吸光分别减小9%和15%，9h减小35%和45%，24h吸光度降为0。2.2.2冷藏避光下维生素C在不同介质中的稳定性图1-13冷藏避光下维生素C应用液在不同介质中的稳定性图1-13显示了冷藏避光条件下，维生素C在4种介质溶液中的稳定性。24h内，维生素C在0.5mol/LNaCl溶液中损失量最少，其次是0.5mol/L食盐，然后是0.05mol/LHAc溶液，在水溶液中损失最多，即NaCl对维生素C的保护作用最强，其次是食盐，再次是HAc。2.2.3空气暴露面积对维生素C稳定性的影响用0.5mol/LNaCl和0.5mol/L食盐配制维生素C应用液，放置在直径分别为2.56cm、3.40cm、5.60cm的烧杯中，其与空气接触的表面积分别为5.31cm2、9.07cm2、24.62cm2，冷藏避光保存，测定其随时间的变化，发现在6h内吸光度不随空气暴露面积变化，说明在冷藏避光条件下，空气对维生素C的氧化作用较弱。2.3不同浓度维生素C（0.5mol/LNaCl）溶液的稳定时间用0.5mol/LNaCl溶液配制不同浓度的维生素C溶液（4℃冷藏避光保存），观16 山西医科大学硕士学位论文察其稳定时间，结果如图1-14。图1-14不同浓度维生素C的稳定时间由图可知：随着维生素C标准溶液浓度的减小，其稳定时间也缩短。其中，10µg/ml维生素C溶液放置9h，吸光度减小5%；40µg/ml维生素C溶液2d内吸光度无明显变化，3d开始减小，5d减小3%，7d减小9%；1000µg/ml维生素C溶液6d内吸光度无明显变化，7d减小2%，2w减小10%。本实验使用1000µg/ml的维生素C储备液可保存7天使用。17 山西医科大学硕士学位论文3讨论综合以上结果，本实验选择用0.5mol/LNaCl为溶剂配制维生素C标准储备液，并将配制好的溶液置于4℃冷藏避光处，7天内使用。维生素C在酸性环境中较稳定，因此，多数文献采用酸溶液作为介质稳定维生素C。本文特色在于采用NaCl溶液为溶剂稳定维生素C，不仅稳定效果好，而且对后续测定无干扰。将NaCl推广为食用盐稳定维生素C，可以应用于实际生活，具有一定的实用性。18 山西医科大学硕士学位论文4结论通过对维生素C标准应用液（10µg/ml）稳定性的研究，按吸光度值减小≥5%视为有变化，得到以下结论：⑴维生素C的蒸馏水溶液不稳定，吸光度在2h减小30%，7h变为0，0.5mol/LNaCl溶液可以延长其稳定时间，8h内吸光度基本不变；维生素C在自来水中最不稳定，3h全部被氧化；⑵食盐可提高维生素C的稳定性，且随着食盐浓度的升高，其稳定性提高。其中，维生素C在0.5mol/L的食盐中可稳定3h；0.25mol/L稳定2h；0.05mol/L稳定1h；⑶维生素C的0.05mol/LHAc溶液可稳定3h；0.001mol/L陈醋可使维生素C溶液稳定1h；⑷4℃冷藏避光条件下，维生素C的损失量最小，9h吸光度减小1.4%，常温见光和常温避光保存下，7h减小4%左右；空气对维生素C的氧化作用较弱；⑸随着维生素C标准溶液浓度的减小，其稳定时间也减短。以0.5mol/LNaCl溶液为溶剂，10µg/ml维生素C溶液可放置9h；40µg/ml可放置3d；1000µg/ml放置7d。19 山西医科大学硕士学位论文第二部分果蔬中维生素C含量的测定维生素C是人体生长发育必需的营养素之一，具有多种生理功能[41]，如预防和治疗坏血病；缓解铅、砷、苯以及细菌毒素等对机体的毒害作用；抗氧化[42]等。但是，人体因缺乏古洛糖内酯氧化酶而不能自身合成维生素C[13]，必须从食物中获取。水果和蔬菜维生素C含量丰富[14]，人体所需98％的维生素C都来源于水果和蔬菜[15]。目前蔬果中维生素C的测定方法较多，主要有2，6-二氯靛酚滴定法[22]、碘量法[43]、2，4-二硝基苯肼法[44]、荧光分光光度法[45]和高效液相色谱法[46-47]等。这些方法各有优缺点，如滴定法简单快速，但不适于有色样品的测定；比色法干扰较大；荧光法操作繁琐费时；高效液相色谱法所需仪器造价高，更适宜多种维生素的同时测定等。本文基于维生素C的水溶液在紫外区265nm波长处有最大吸收，采用Cu2+氧化消除基体干扰，并对反应条件进行了最佳选择，建立了果蔬中维生素C含量的测定方法，并对7种果蔬维生素C的含量进行了检测。该方法操作简便、准确、快速、检出限低。1材料与方法1.1主要仪器Lambda35紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司，1cm石英比色皿)；中佳SC-2556低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；TG328A型电光分析天平(上海天平仪器厂)；ScoutSE电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；雷磁PHS-3C型精密pH计；九阳原汁机（九阳股份有限公司）。1.2主要试剂L-抗坏血酸（分析纯，纯度99.9％）；氯化钠（分析纯）；20 山西医科大学硕士学位论文100µg/ml的硫酸铜溶液（用分析天平准确称取分析纯硫酸铜0.0975g置于250ml容量瓶，用蒸馏水定容。）；乙酸、乙酸钠（分析纯）；乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.02mol/L，pH=4.70）；实验用水均为蒸馏水，电导率≤2μS/㎝。1.3标准溶液配制1000µg/ml的维生素C标准储备液：用分析天平准确称取抗坏血酸0.0500g置于50ml容量瓶，用0.5mol/LNaCl溶液溶解后稀释至刻度。4℃冷藏避光保存，7天内使用。1.4样品的采集、制备与测定1.4.1样品的采集采集市售果蔬样品：彩椒、圣女果、西红柿、白菜、芒果、橙子、猕猴桃。1.4.2样品维生素C的提取将水果、蔬菜样品洗净、沥干，去皮去核后，称取可食部分10g左右，按液料比6：1加入0.5mol/LNaCl进行研磨，获得样品提取液，将提取液以0.5mol/LNaCl定容，移至离心管中，4000r/min，离心10min，取上清液即为待测果蔬提取液。4℃冷藏避光保存。1.4.3样品维生素C的测定样液的测定：准确移取离心上清液1.00~3.00ml（以样品维生素C含量多少为依据）置于10ml比色管中，加1.0ml乙酸-乙酸钠缓冲液，用0.5mol/LNaCl稀释至刻度，摇匀。在波长265nm处，以0.5mol/LNaCl为参比，测定其吸光度。加铜处理样液的测定：吸取1.00~3.00ml样液，加入0.50ml100µg/mlCuSO4溶液，再加入1.0ml乙酸钠缓冲液，按上述方法测定其吸光度。21 山西医科大学硕士学位论文1.5结果计算在标准曲线上查出待测样品与经加铜处理后待测样品的吸光度值，相减即可计算出样品中维生素C的含量，也可直接以待测加铜处理样液为参比，测得待测样液的吸光值，由标准曲线计算出样品中维生素C的含量[mg/100g]。cVV100总待测总维生素C含量=VW10001总式中：c为依标准曲线方程计算得到的维生素C浓度，µg/ml；V1为测吸光度时吸取样品溶液的体积，ml；V总为吸取样品定容总体积，ml；V待测总为待测样品总体积，ml；W总为果蔬质量，g；100为100g果蔬。22 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1实验条件选择2.1.1酸度对吸收波长的影响用2%HCl和0.1mol/LNaOH调节的维生素C标准溶液的pH值，使其分布在2~10之间。以0.5mol/LNaCl为参比溶液，在波长200~300nm范围内进行扫描，结果如图2-1。图2-1不同酸度下维生素C测定波长的变化实验结果表明，随着pH值的不同，维生素C的最大吸收波长有所变化。pH＜4时，最大吸收波长紫移，pH＞7时，吸光度值明显减小，这是由于在碱性环境中维生素C不稳定而引起的。pH值在4~5时，最大吸收波长不变，为265nm，吸光度值较大，综合考虑，实验用0.2mol/LHAc-NaAc调节体系pH值，使其稳定在pH为4.7附近。2.1.2破坏剂的选择维生素C溶液在碱性环境和有氧化剂存在时不稳定，文献多用NaOH[31]、Fe3+[48]、Cu2+[49]、H[18]3+2O2等破坏维生素C。本文对维生素C破坏剂进行选择，发现Fe、H2O2在265nm处有较大的吸收，NaOH对维生素C的破坏作用较缓慢，需要加热促进，而Cu2+对维生素C的破坏完全且较快，在测定波长处本底吸收很小，因此，本实验选择23 山西医科大学硕士学位论文Cu2+为破坏剂。2.1.3Cu2+用量的选择以Cu2+为破坏剂，观察Cu2+对维生素C的破坏作用。分别测定了维生素C和经Cu2+氧化后的维生素C在紫外区的吸收光谱，结果显示还原型维生素C在265nm处有最大吸收峰，经Cu2+氧化后生成的氧化型维生素C在265nm处无吸收，即加入Cu2+后，可将还原维生素C破坏。实验取100µg/ml标准维生素C溶液1.00ml于数支10ml比色管中，加入1.00ml乙酸-乙酸钠缓冲液，并分别加入不同量的100µg/mlCuSO2+4溶液测定吸光度值，发现Cu的用量在0.50ml以上时，维生素C被完全破坏，测出的仅是Cu2+的吸光度值，其本底值为0.0459。结果见表2-1、2-2。表2-1不同用量Cu2+破坏10µg/ml维生素C后的吸光度值（n=3）100µg/mlCuSO4加入量（ml）00.501.002.005.00吸光度0.67300.04590.07890.14800.3350表2-2不同用量Cu2+的吸光度值（n=3）100µg/mlCuSO4加入量（ml）0.501.002.005.00吸光度0.04590.07800.14300.3330本实验选择Cu2+加入量为5µg/ml。2.1.4样品提取剂浓度的选择第二部分表明维生素C标准溶液在NaCl溶液稳定性最好，因此本章选择NaCl为样品提取剂。将橘子榨汁，取3.00ml橘汁，分别加入18.00ml不同浓度的NaCl溶液进行提取，测定其吸光度，结果见表2-3。表2-3样品提取剂的选择（n=3）NaCl浓度（mol/L）00.050.1250.250.5吸光度0.49180.54400.56590.57770.6724由表2-3可看出，0.5mol/LNaCl溶液的提取效率最高且测定灵敏度也高，本实验选择0.5mol/LNaCl为提取液。2.1.5样品提取剂用量的选择24 山西医科大学硕士学位论文称取4份橘子样品各10.00g左右，以1：1，3：1，6：1，10：1的液料比，按实验方法提取后进行测定，结果见图2-2。图2-2液料比对样品测定的影响由图可知：随着液料比的增加，测得的样品维生素C含量值也增加，当液料比超过6以后，样品含量测定值基本不变。表明，当浸提的料液比过小时，维生素C提取不完全，导致所测结果偏低。本实验液料比采取6：1。2.2标准曲线及线性范围以0.5mol/LNaCl为溶剂，加入1.00ml乙酸钠缓冲溶液，配制一系列维生素C标准溶液，在265nm处，以0.5mol/LNaCl为参比溶液测定吸光度。维生素C浓度在1.0~15.0µg/ml范围内，线性关系良好，r＞0.999，回归方程为Y=0.0677X－0.0526。2.3方法检出限分别测定试剂空白10份，吸光度值见表2-4。在置信度约90％时，取置信系数K=3，其检出限L=K·SD／S=0.062µg/ml。表2-4空白10次平行测定结果吸光度值xsRSD（%）0.05760.05600.05640.05680.05650.0576±0.00142.370.05880.05930.05670.06000.057425 山西医科大学硕士学位论文2.4精密度实验按上述实验方法分别对每种果蔬样品制备6个平行样，进行测定，结果见表2-5，其相对标准偏差(RSD)在0.92%~5.66%之间。表2-5方法精密度实验结果（n=6）6次测定结果（µg/g）RSD试样xs123456(%)圣女果1257.28253.00256.73247.89246.79252.86252.43±4.361.73圣女果2320.15311.25334.59331.11326.34325.82324.88±8.302.55彩椒991.12992.86998.63997.671022.12988.04998.41±12.281.23西红柿87.7090.5193.0287.9290.0390.4489.94±1.962.18猕猴桃11480.961489.671484.061489.481431.211488.901477.40±22.901.55猕猴桃2488.02487.92491.85489.04491.85505.01492.28±6.481.32大芒果238.21243.91245.47242.35239.46249.14243.09±4.011.65小芒果107.5096.22108.48114.68108.08104.80106.63±6.045.66橙子299.96303.91298.39300.70305.55299.59301.35±2.770.922.5准确度实验采用加标回收率的方法进行准确度的评价。向已知浓度的样品中加入三个浓度的标液，按上述实验方法测定样品，平行6次，结果见表2-6。回收率在88.75%~103.65%之间。表2-6方法回收率实验结果（n=6）样品含量加标量测定结果（n=6）试样回收率（%）（µg/ml）（µg/ml）（µg/ml）4.009.0290.5圣女果5.406.0010.8090.08.0012.3288.7彩椒7.668.0015.3896.6西红柿3.606.009.85103.64.009.7594.5橙子5.976.0011.4891.88.0013.5694.8猕猴桃7.795.0012.4993.4芒果14.604.008.4295.5芒果26.544.0010.5399.72.6样品的测定26 山西医科大学硕士学位论文按上述实验方法测定样品，平行6次，结果见表2-7。表2-7样品维生素C检测结果（n=6）样品含量样品含量试样(mg/100g)试样(mg/100g)xsxs圣女果125.25±0.43猕猴桃1147.75±2.29圣女果232.49±0.35猕猴桃249.25±0.65彩椒99.84±1.07橙子30.12±0.28西红柿9.00±0.83芒果（大头）24.30±0.40白菜--芒果（小头）10.66±0.60注：--表示低于检测限两种圣女果维生素C含量经t检验，t=-17.94，P＜0.05，按α=0.05，差别有统计学意义；猕猴桃维生素C含量，经t检验，t=-101.44，P＜0.05，按α=0.05，差别有统计学意义。27 山西医科大学硕士学位论文3讨论综合以上结果，本实验选择用0.5mol/LNaCl，按液料比6：1提取样品中的维生素C，用5µg/mlCu2+氧化维生素C，利用两次吸光度的差值测定维生素C的含量。并采用0.2mol/LHAc-NaAc调节体系pH。28 山西医科大学硕士学位论文4结论⑴果蔬用0.5mol/LNaCl溶液，按液料比为6：1提取维生素C，以Cu2+为破坏剂扣除基体的空白值，利用紫外分光光度法进行测定，在1.0~15.0µg/ml浓度范围内，线性关系良好，r＞0.999，RSD在0.92%~5.66%之间，回收率在88.7%~103.6%之间；⑵7种蔬果维生素C含量差别较大，其中猕猴桃含量最大，为147.75mg/100g，白菜含量低于方法检测限（0.062µg/ml）。同种蔬果不同品种维生素C含量有差别，如两种圣女果维生素C含量分别为25.25mg/100g和32.49mg/100g，经t检验，t=-17.94，P＜0.05，差别有统计学意义；猕猴桃维生素C含量分别为147.75mg/100g和49.25mg/100g，相差近3倍。29 山西医科大学硕士学位论文第三部分果汁中维生素C稳定性的研究随着人们生活水平的提高，膳食结构的改变和饮食的多样化，饮用自制鲜榨果汁成为许多家庭的时尚选择。果汁因“绿色、营养、环保、健康”等特点越来越多地受到青睐，成为日常生活的常见饮品。众所周知，水果中富含大量的维生素C，但是由于维生素C的不稳定性，使得果汁在放置过程中遭受破坏而损失，是人们膳食营养的研究课题之一。了解果汁中维生素C随时间的变化情况，可以引导人们有效地利用维生素C。1材料与方法1.1主要仪器Lambda35紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司，1cm石英比色皿)；中佳SC-2556低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；雷磁PHS-3C型精密pH计；ScoutSE电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；九阳原汁机（九阳股份有限公司）。1.2主要试剂L-抗坏血酸（分析纯，纯度99.9％）；氯化钠（分析纯）；100µg/ml硫酸铜（分析纯）；乙酸、乙酸钠（分析纯）；乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.02mol/L，pH=4.70）；实验用水均为蒸馏水，电导率≤2μS/㎝。1.3样品的采集、制备与测定30 山西医科大学硕士学位论文1.3.1样品的采集采集果蔬样品：橘子、橙子、猕猴桃。市售果汁样品：超市选购汇源橙汁、美汁源果粒橙。1.3.2样品的处理果蔬样品处理：取新鲜样品，洗净、去皮去核后，用榨汁机现榨果汁。分别在不同的时间间隔内取3.00ml果汁，按液料比6：1加入0.5mol/LNaCl溶液，摇匀，移至离心管中，4000r/min，离心10min，取上清液进行检测。市售果汁处理：将果汁摇匀，按上述步骤进行处理。1.3.3样品的测定样液的测定：准确移取离心上清液1.00~3.00ml（依据样品维生素C含量）置于10ml比色管中，加1.0ml乙酸钠缓冲液，用0.5mol/LNaCl稀释至刻度，摇匀。在波长265nm处，以0.5mol/LNaCl溶液为参比，测定其吸光度。加铜处理样液的测定：吸取1.00~3.00ml样液，加0.50ml100µg/mlCuSO4溶液，加1.0ml乙酸钠缓冲液，用0.5mol/LNaCl溶液稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其吸光度。样品中维生素C的含量为待测样品与待测加铜处理样品的吸光度值之差。1.4结果计算榨汁后第一次测定得到的吸光度认为没有损失，记为100％；将不同时间段测得的吸光度值与第一次进行比较，得到不同时间段样品吸光度变化百分比。以时间为横坐标，吸光度百分比为纵坐标，绘制果汁样品维生素C的稳定性曲线。31 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1果汁的稳定性分别测定0、0.5、1、2、3h鲜榨果汁及市售果汁中维生素C的含量，绘制其稳定性曲线，结果如图3-1。图3-1果汁维生素C的稳定性由图可知，随着时间的延长，果汁中维生素C的含量有不同程度的减小。不同果汁维生素C随时间的变化率不同，鲜榨果汁中，猕猴桃汁3h内减小3.0%；橙汁0.5h减小6.0%，3h减小10%；橘汁0.5h减小13.5%，3h减小50%。这可能与水果本身维生素C的含量、糖含量、有机酸种类、酸度、维生素E含量[50]有关。市售果汁中，美汁源果粒橙3h内减小3.0%；汇源果汁0.5h减小3.0%，1h减小了11.2%，3h减小20%，这可能与果汁中添加剂有关。2.2橙汁加入食用盐后的稳定性将橙子榨汁后，立即加入不同量的食用盐，使其浓度分别为0、0.05、0.125、0.25、0.5mol/L，测定0、0.5、1、2、3h橙汁中维生素C的含量，结果如图3-2。32 山西医科大学硕士学位论文图3-2食盐对橙汁中维生素C的稳定性的影响由图可知，食用盐对果汁中维生素C的稳定性的影响不大，即加入食盐后并没有显著的提高维生素C的稳定性。2.3橙汁及果粒橙稀释后的稳定性将橙子榨汁后，分成两部分，一部分自然放置，一部分按1:1加入煮沸冷却后的自来水放置，测定这两种情况下橙汁中的维生素C随时间的变化情况，结果如图3-3。果粒橙离心后分成两部分，按上述步骤操作，结果如图3-4。图3-3加水对橙汁中维生素C的稳定性的影响通过对比橙汁原汁与稀释后的维生素C的变化率，可以知道，在自然条件下，橙汁中的维生素C相对稳定，氧化速率慢，30min内减小6%，从30min到2h，变化不显著，4h减小12%，而加水稀释的橙汁30min减小12%，2h减小20%，4h减小40%。由33 山西医科大学硕士学位论文此可知，果汁加水后维生素C氧化速率加快，稳定性变差。水的存在加剧了维生素C的氧化，因此原果汁中维生素C稳定性好。图3-4加水对果粒橙中维生素C的稳定性的影响从图可看出，0~2h内，原果粒橙及稀释后果粒橙维生素C稳定性无明显差异，3h可以看出其差异变化，说明，果汁加水后维生素C氧化速率变快。2.4光照与温度对鲜榨橘汁维生素C稳定性的影响将榨好的橘汁分别放置在常温（20℃）见光、常温避光和冷藏避光处，测定其随时间的变化，结果如图3-5。图3-5样品在不同条件下的稳定性通过对比冷藏避光与常温避光保存下橘汁维生素C的变化率，可以知道，冷藏避光条件下，3h内样品吸光度值都基本不变，常温避光吸光度减小38%，这表明在避光34 山西医科大学硕士学位论文条件下，随着温度的升高，维生素C稳定性降低，其保存率差异显著。通过对比常温避光与常温见光保存下橘汁维生素C的变化率，可以知道，常温避光保存下吸光度3h减小38%，常温见光减小40%，这表明在相同的温度下，维生素C对光照不敏感。温度和光照2个因素相比，温度是橘汁维生素C变化率的影响主要因素。相同的光照下，保存温度越低，稳定性越高。因此，低温及短时间储存有利于橘汁保持高维生素C含量。本实验选择将处理好的样品置于4℃冷藏避光保存。2.5鲜榨橘汁暴露在空气中的面积对维生素C稳定性的影响将榨好的橘汁放置在直径分别为2.56cm、3.40cm、5.60cm的烧杯中，其与空气接触的表面积分别为5.31cm2、9.07cm2、24.62cm2，冷藏避光保存，测定其随时间的变化，发现在3h内吸光度不随空气暴露面积变化，说明在冷藏避光条件下，空气对果汁中维生素C的氧化作用较弱。35 山西医科大学硕士学位论文3讨论果汁维生素C随时间的延长，稳定性下降，且不同果汁维生素C随时间的变化率不同，其原因可能是：鲜榨果汁与水果本身维生素C含量、糖含量、有机酸种类、酸度、维生素E含量有关；市售果汁与其添加剂有关。36 山西医科大学硕士学位论文4结论稀释对果汁中维生素C的保存最为不利，同时随时间的延长、温度的升高，保存率减小。37 山西医科大学硕士学位论文参考文献[1]徐经采.微量元素与维生素的关系[J].药学通报,1987,5:23-24.[2]刘晓梅.维生素C的临床不合理应用及常见不良反应[J].临床合理用药杂志,2012,05(25):37-38.[3]SchleicherRL,CarrollMD,FordES,DavidAL.SerumvitaminCandtheprevalenceofvitaminCdeficiencyintheUnitedStates:2003-2004NationalHealthandNutritionExaminationSurvey(NHANES)[J].AmJClinNutr,2009,90(5):1252-1263.[4]CarrA,FreiB.DoesvitaminCactasapro-oxidantunderphysiologicalConditions[J].FASEBJ,1999,13(9):1007-1024.[5]陈国烽,王亚军.维生素C在新陈代谢中的生理功能[J].中国食物与营养,2014,20(1):71-74.[6]曾翔云.维生素C的生理功能与膳食保障[J].中国食物与营养,2005,(4):52-54.[7]VillalpandoS,ShamahT,RiveraJA,LaraY,MonterrubioE.Fortifyingmilkwithferrousgluconateandzincoxideinapublicnutritionprogramreducedtheprevalenceofanemiaintoddlers[J].JNutr,2006,136(10):2633-2637.[8]DeTullioMC.Beyondtheantioxidant:ThedoublelifeofvitaminC[J].SubcellBiochem,2012,56:49-65.[9]叶运莉,杨艳.我国维生素C缺乏研究的进展[J].职业卫生与病伤,2003,18(1):54-56.[10]陈莉.维生素C的临床应用问题[J].基层医学论坛,2012,16(4):497.[11]朱晓明.过量使用维生素C的不良反应[J].中国社区医师（医学专业）,2011,13(10):11.[12]中国营养学会.中国居民膳食营养素参考摄入量[M].北京:中国轻工业出版社,2013:28.[13]SmiroffN,ConklinPL,LoewusFA.Biosynthesisofascorbicacidinplants:Arenaissance[J].AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,2001,7(52):437-467.[14]MassoudNejati-Yazdinejad.Indirectdeterminationofascorbicacid(vitaminC)byspectrophotometricmethod[J].InternationalJournalofFoodScience&Technology,2007,42(12):1402-1407.[15]李军明,张军.体内维生素的生理功能和日常保健的科学合理摄取[J].中国食物与营养,2009(03):53-55.38 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山西医科大学硕士学位论文都凤华等[8]从糖、VE、有机酸及pH等因素入手，探讨了沙棘汁中维生素C稳定性的内因所在及影响程度。实验表明：沙棘汁中维生素C的稳定性与汁中糖含量有一定的关系，不同浓度的糖对维生素C的影响不同，其中10%的糖对维生素C的稳定效果优于20%；维生素C的稳定性与沙棘汁中低的pH有关，而与有机酸种类关系不大；维生素C的稳定性与VE及其含量密切相关，VE的含量与维生素C稳定性呈正相关。43 山西医科大学硕士学位论文2维生素C的检测方法2.1滴定分析法滴定分析法主要有2，6-二氯靛酚滴定法、直接碘量法等。2，6-二氯靛酚滴定法是国标GB/T6195-1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法》的方法，其原理是：2，6-二氯酚靛酚染料可将还原型抗坏血酸氧化为脱氢型；该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变为无色[22]。因此，用2，6-二氯酚靛酚滴定含有维生素C的酸性溶液时，当到达滴定终点时，染料被还原为无色，剩余的染料则表现为浅红色，可以根据染料消耗量计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。该法简便易行，但是由于许多果蔬都含有色素物质，其维生素C提取液通常有颜色，滴定终点不易辨认。所以，此类方法对浅色果蔬测定结果比较可靠，但不适于深色果蔬的测定[9]。直接碘量法是根据碘可定量氧化维生素C直接进行滴定的。库尔班江等[10]采用碘量法对对新疆伊宁市当地产的水果、蔬菜中维生素C的含量进行了测定，结果表明：在5~100mg/L的范围内，线性关系良好，相关系数为0.998，平均回收率为105.02％。该方法变色敏锐，具有简便、易行、准确度高的优点，但不适宜低含量的样品的测定。2.2分光光度法分光光度法包括2，4-二硝基苯肼比色法、紫外分光光度法等。2，4-二硝基苯肼比色法是GB/T5009.86-2003推荐的第二法，其原理是在维生素C的草酸溶液中加入活性炭，使其氧化成脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼反应生成红色的脎，其含量与抗坏血酸含量成正比[11]。该方法简单易行，成本较低，但干扰较多。若溶液中存在丙酮酸，也可与其反应生成脎；若待测溶液本身有颜色，也会影响测定。紫外分光光度法是基于维生素C在紫外区有特征吸收而建立的方法。郑京平等[12]利用维生素C这一特性和其对碱的不稳定性，在波长243nm处测定样品溶液与碱处理样品两者吸光度之差计算出样品中维生素C的含量。实验表明：维生素C浓度在1.00~12.00µg/ml范围内，线性关系良好，相关系数r=0.9999，检出限为0.014µg/ml，44 山西医科大学硕士学位论文回收率在97.9％~99.0％之间。该方法简单易行、结果准确、灵敏度高、检出限低、重现性好、特别适合深色样品的测定。张立科等[13]以Cu2+作催化剂校正基体干扰，测定了香蕉、西红柿等果蔬中的维生素C含量，经多次实验得出：在0~450µg/ml线性范围内，RSD在0.32％~0.89％之间，检出限为0.279µg/ml，加标回收率在97.16％~100.18%之间，结果令人满意。2.3荧光法荧光法是国标GB/T5009.86-2003推荐的第一法，是先用偏磷酸-乙酸溶液提取样品中的维生素C，然后用活性炭将其氧化，再在乙酸钠的溶液中与邻苯二胺缩反应，合成具有蓝色荧光的喹喔啉，于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度，其荧光强度与维生素C的浓度呈正比[14]。该方法较为简便，灵敏度和准确度高，重现性好，但是操作较为繁琐，且当样品中存在丙酮酸时，亦可以与邻苯二胺反应产生荧光物质，造成干扰。2.4电化学法电化学分析法直接利用电信号的变化对物质进行测定，根据所测量电学量的不同，主要有电导分析法、库仑滴定法、伏安法、极谱分析法。白先群等[15]利用电导法测定维生素C，在1.0~5.0g/L范围内，维生素C的含量与溶液的电导率呈线性关系，相关系数r=0.998，回收率在99.2％，该法虽然简便、快捷，但容易受外界条件如温度等的影响。韩树波等[16]采用电极埋植方法，用半微分伏安法测定大蒜中的维生素C，结果表明：在pH=6.8的磷酸氢钠-柠檬酸介质中，维生素C在7.0×10-2~3.2×102mg/ml范围内，线性关系良好，相关系数r=0.998，相对标准偏差为6.2%，最低检出浓度为4.0×10-2mg/L。陈志慧[17]利用两点电位滴定法测定荔枝中维生素C，该方法只需在滴定过程中的适当位置记录2次滴定数据，即可计算滴定的化学计量点，且计算结果为理论上的化学计量点，经三次测定，相对标准偏差为0.12%，提高了测定的准确度和精密度，是一种准确、简便、快速的方法。45 山西医科大学硕士学位论文王佳露等[18]建立了极谱法测定维生素C的方法，对芒果中的维生素C含量进行7次平行实验，在10~100µg/ml范围内，线性关系良好，RSD为0.665％，检出限为0.279µg/ml，加标回收率在93.4％~95.8%之间。该方法具有重现性好、检测灵敏度高等优点，但汞蒸气有毒，易造成污染。2.5毛细管电泳法毛细管电泳是近年新兴的分析方法，具有效率高、分析时间短、样品处理简单等特点。杨建洲等[19]采用毛细管电泳法对果蔬中的维生素C进行了测定，结果满意。2.6高效液相色谱法随着高效液相色谱(HPLC)的日益普及，应用HPLC测定维生素C是目前最常用的分析方法之一。它可以选择不同的色谱柱及流动相，使待检测物质和其他共存成分实现分离。此方法不仅分离分析速度快，仅需几分钟或十几分钟，而且可选用紫外、荧光、电化学及质谱等各种高灵敏度检测器，检测组分含量低至10-9~10-10g/ml。它对多种维生素的同时测定更具有优势[20]，但缺点是所用仪器较为昂贵，使用费用较高[21]。王艳颖[22]利用HPLC测定草莓中维生素C的含量，流动相为0.1％的草酸，在浓度为20~100µg/ml范围内有良好的线性关系，相关系数达0.999，回收率在97.4％~102.1％之间，RSD小于3％，该方法简便、快速、准确和稳定，适合于测定水果和蔬菜中维生素C的含量。雍莉等[23]以0.01mol/LNH4Ac-HAc缓冲溶液(pH=4.5)为流动相，经C18色谱柱分离，在262nm波长下用紫外检测器测定维生素C的吸光度值，以保留时间定性，峰面积定量。结果表明：本方法的线性范围为0.50~1000µg/ml，检出限为50µg/ml，回收率为88.57％~99.12％，相对标准偏差为1.31~2.82％。综上所述，食物中维生素C的测定方法较多，各有优缺点，如滴定法和比色法适于浅色果蔬的测定，而分光光度法也适于深色样品的测定，直接碘量法适宜高含量样品的测定，高效液相色谱法不仅灵敏度高，且适于多种维生素C的同时测定。46 山西医科大学硕士学位论文因维生素C不稳定，会对测定结果的准确度产生较大影响，所以应特别注意维生素C保存条件及在样品处理和测定过程中的损失。47 山西医科大学硕士学位论文参考文献[1]MassoudNejati-Yazdinejad.Indirectdeterminationofascorbicacid(vitaminC)byspectrophotometricmethod[J].InternationalJournalofFoodScience&Technology,2007,42(12):1402-1407.[2]李军明,张军.体内维生素的生理功能和日常保健的科学合理摄取[J].中国食物与营养,2009,(03):53-55.[3]AntonelliML,DAscenzoG,LaganàA,PuscedduP.Foodanalyses:anewcalorimetricmethodforascorbicacid(vitaminC)determination[J].Talata,2002,58(5):96l-967.[4]TorregrosaF,EsteveMJ,FrlgolaA,CortesC.Ascorbicacidstabilityduringrefrigeratedstorageoforange-carrotjuicetreatedbyhighpulsedelectricfieldandcomparisonwithpasteurizedjuice[J].FoodEngineering,2006,73:339-345.[5]OzkanM,KircaA,CemerogluB.Effectsofhydrogenperoxideonthestabilityofascorbicacidduringstorageinvariousfruitjuices[J].FoodChem,2004,88:591-597.[6]董月菊,戴洪义.不同试验条件对脐橙鲜榨汁中维生素C稳定性的影响[J].食品研究与开发,2011,32(1):41-45.[7]韩兰英,张智怡.猕猴桃中维生素C稳定性的研究[J].上饶师范学院学报,2012,32(3):68-72.[8]都凤华,田兰英,王晶,王丽.沙棘汁中维生素C稳定性的研究[J].食品工业科技,2006,27(1):81-83.[9]朗杰,郑玉光.香椿芽的SOD和维生素C测定[J].食品工程,2008(1):62-63.[10]库尔班江,赛丽曼.碘量法测水果蔬菜中维生素C的含量[J].伊犁师范学院学报(自然科学版),2007(3):28-32.[11]薛刚,刘文红,黄海涛,傅彤.2,4-二硝基苯肼比色法测定婴幼儿配方食品和乳粉及其制品中总抗坏血酸(VC)的含量[J].食品研究与开发,2000,21(3):48-49.[12]郑京平.水果蔬菜中维生素C含量的测定——紫外分光光度快速测定[J].光谱实验室,2006,23(4):731-735.[13]张立科,田水泉,谢太平,张洪浩,范顺利.紫外可见分光光度法测定果蔬中的维生素C[J].河北化工,2009,32(1):50-52.48 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山西医科大学硕士学位论文致谢本文是在张加玲教授的指导下完成的。研究生期间，张老师不论是在学习中还是在生活中，都给了我很大帮助。学习中，老师严格要求我们，求真、务实、勤奋、创新、认真、笃学、谦虚、谨慎，才使我各方面的能力得到提高。在生活中，张老师也给予我诸多关怀，教我们做人做事的道理，教我们友善、儒雅、健康、向上。值此论文完成之际，谨向我最敬爱的导师张加玲教授致以最诚挚的谢意！感谢刘桂英、王东新、张萍、阎小青、高林英、刘云凤、边霞老师对我实验的支持、建议和帮助！感谢张红霞、程莉、王梦等同学对我实验上的建议和生活中的帮助！感谢我的父母、家人，感谢他们给予我的理解和支持！感谢所有关心、支持、帮助过我的老师、同学和朋友们！50 山西医科大学硕士学位论文在学期间承担/参与的科研课题与研究成果研究成果[1]王海佳,张加玲.邻二氮菲分光光度法测定婴幼儿米粉中铁含量[J].中国食物与营养,2014,20(09):60-62.51 山西医科大学硕士学位论文个人简介王海佳，女，1988年4月5日出生，汉族，山西省太原市人。2007年9月考入山西医科大学公共卫生学院预防医学专业，2012年7月本科毕业并获得医学学士学位。2012年9月考入山西医科大学公共卫生学院预防医学系公共卫生硕士专业。52'