变色酸2b分光光度法测定蛋白质

'第26卷第5期西南师范大学学报(自然科学版)2001年10月Vol.26No.5JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScience)Oct.2001文章编号:1000-5471(2001)05-0594-05变色酸2B分光光度法测定蛋白质¹胡庆红,刘绍璞,罗红群西南师范大学环境化学研究所,重庆400715摘要:在pH值为112~210的Clark-Lubs缓冲溶液中,变色酸2B与蛋白质结合形成复合物,导致变色酸2B褪色,其最大褪色波长位于530nm.不同蛋白质在0~30Lg/mL至0~50Lg/mL范围内服从Beer定律,其表观摩尔吸光系56-1-1数视蛋白质的不同分别在111@10~112@10L#mol#cm之间.方法不仅具有高灵敏度,而且选择性好、简便快速.用于人血清样品中总蛋白质量的测定,结果满意.关键词:变色酸2B;蛋白质;分光光度法中图分类号:O629173;O65713文献标识码:A蛋白质含量测定对于生化、药物、食品及临床检验具有重要意义.分光光度法因其简便、快速、经济[1][2]和准确等特点而受到关注.如早期研究的溴甲酚绿法,考马斯亮蓝法.近年来又发现了一些新体系和新方法,它们主要利用酸性三苯甲烷和变色酸双偶氮染料以及金属-染料螯合阴离子与蛋白质的结合反应,[3][4][5][6][7]如溴酚蓝、氯磺酚S、偶氮胂K,Mo(Ö)-邻苯二酚紫、钛(Ô)-4,5-二溴苯基荧光酮法等.但变色酸单偶氮染料与蛋白质的显色反应及其分析应用尚未引起人们的注意.变色酸2B(2-[(4-硝基苯)偶氮]-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸,缩写为Ch2B),是一种含吸电子基团-NO2的变色酸单偶氮染料,由于苯基上不含螯合基团,与金属的螯合能力较弱,虽能与一些金属离子产生显色4-1-1[8]反应,但灵敏度很低.E值一般均低于1@10L#mol#cm.故目前很少用于光度分析.变色酸2B的结构式为OHOHO2NNNHO3SSO3H我们的实验发现:在酸性溶液中变色酸2B呈红色,最大吸收位于515nm.当与蛋白质反应形成复合物后,产生显著的褪色反应,以试剂空白为参比时,其最大褪色波长位于530nm,在一定范围内蛋白质的浓度与吸光度差值$A(A0-A)值成正比,反应具有很高的灵敏度.视蛋白质的不同,其表观摩尔吸光56-1-1系数在111@10~112@10L#mol#cm之间.可用于蛋白质的测定.方法简便、快速、准确度高和选[2]择性好,用于人血清中蛋白质的测定,结果与考马斯亮蓝法一致.¹收稿日期:2001-01-09作者简介:胡庆红(1963-),男,贵州遵义人,讲师,现在遵义医学院基础化学教研室工作.通讯联系人:刘绍璞. 第5期胡庆红,等:变色酸2B分光光度法测定蛋白质5951实验部分111仪器与试剂UV-8500紫外-可见分光光度计(华美公司),pHS-3C酸度计(上海大中分析仪器厂),721A分光光度计(四川仪器九厂).蛋白质标准溶液:牛血清白蛋白(BSA,上海丽珠东风生物技术有限公司)100Lg/mL溶液,人血清白蛋白(HSA,上海生物制品研究所)、溶菌酶(Leso,华美生物工程公司)、糜蛋白酶(Chy,进口分装)、卵白蛋白(OVA,Sigma公司)、C-球蛋白(C-G,成都生物制品公司),以上均为200Lg/mL溶液.变色酸2B(上海新中-4-1[9]-1-1化学厂)溶液:115@10mol#L,Clark-Lubs缓冲溶液:012mol#LHCl和012mol#LKCl按一定比例混合,配制一系列不同pH值的缓冲溶液,再用酸度计校正pH值.HCl和KCl为分析纯,所用水均为二次蒸馏水.112实验方法在10mL比色管中,加入变色酸2B溶液217mL,pH值为1185缓冲溶液110mL,加入适量BSA标准溶液,用二次蒸馏水定容,摇匀.以试剂空白作参比,用1cm比色皿于530nm波长处,测量溶液的吸光度差值$A.2结果与讨论211吸收光谱图1(a)和(b)为变色酸2B-BSA体系的吸收光谱.从图中看出,在pH值为1185的缓冲溶液中,以水为参比时,变色酸2B的最大吸收波长为515nm,当变色酸2B与BSA反应形成复合物时,将产生显著褪色反应.以试剂空白为参比时,变色酸2B的最大褪色波长为530nm.与此同时,在418nm和580nm处出现两个正吸收峰,但灵敏度较低.故在530nm处以褪色法进行测定.(a)11Ch2B;21Ch2B-BSA(水作参比);(b)Ch2B-BSA(试剂空白作参比).[Ch2B]=4@10-5mol#L-1,[BSA]=30Lg#mL-1.图1吸收光谱Fig11AbsorptionSpectra212适宜的反应条件21211酸度的影响试验了不同pH值的Clark-Lubs缓冲溶液酸度对褪色反应的影响.结果表明pH值在112~210范围内结合产物的$A最大且稳定,pH值小于112或pH值大于210时,$A下降(图2).本实验选择pH值为1185的缓冲溶液.当缓冲溶液用量为015~115mL时,体系的$A最大且稳定,本实验选用pH值为1185 596西南师范大学学报(自然科学版)第26卷的缓冲溶液110mL.21212显色剂用量的影响试验了显色剂用量的影响,结果表明变色酸2B溶液用量为210~310mL时,体系的吸光度值最大且稳定,本实验选用217mL.21213反应时间及稳定性在室温下10min内显色完全,吸光度值达最大,此后吸光度值在60min内几乎不变.21214表面活性剂以及乙醇的影响为了解表面活性剂是否对褪色反应有增敏作用,试验了3种不同类型的表面活性剂和乙醇对反应的影响.实验表明非离子表面活性剂TritonX-100,阴离子表面活性剂SDBS和乙醇均使体系吸光度值降低,阳离子表面活性剂CPB使体系吸光度值略有增加(图3).11Ch2B(水空白);21Ch2B~BSA(水空白);31Ch2B~BSA(试剂空白).11CPB(20Lg/mL);21TritonX-100(012%);31SDBS(20Lg/mL);41乙醇(95%).图2pH值的影响图3表面活性剂以及乙醇的影响Fig12EffectofpHFig13EffectofSurfactantsandEthanol21215离子强度的影响[10-12]蛋白质与染料结合主要依靠静电结合作用,在酸性溶液中,蛋白质的氨基酸残基带正电荷,与-1染料的阴离子静电结合.加入氯化钠和硫酸钠进行离子强度实验:当NaCl浓度在112g#L,Na2SO4浓度-1-1-1在0114g#L以内时,吸光度几乎不变;当NaCl浓度增至12g#L,Na2SO4浓度增至114g#L时,吸光-1-1度降低36%;NaCl浓度再增至18g#L,Na2SO4浓度增至7g#L时,吸光度降低60%.说明随着离子化合物浓度的增大,阴离子与蛋白质竞争反应,导致蛋白质与染料结合作用减弱,体系的吸光度降低.同时2--说明二价阴离子SO4比一价阴离子Cl与蛋白质竞争反应更强,体系的吸光度降低更显著.213共存物质的影响在10mL比色管中,当BSA的含量为100Lg,测定误差小于?5%时,共存物的允许量(以Lg计)分别**为:L-甘氨酸(5000),DL-苏氨酸(5000),L-色氨酸(5000),DL-半胱氨酸(3000),L-胱氨酸(4000),DL-天*冬氨酸(5000),L-苯丙氨酸(2000),D-苏氨酸(4000),L-白氨酸(500),L-组氨酸(5000),D-色氨酸(5000),L-异白氨酸(3000),L-酪氨酸(1000),柠檬酸(9500),葡萄糖(1000),果糖(3000),抗坏血酸(4000),尿素2+2+2+2+2+(300),酵母RNA(52),鲱鱼精DNA(52),Pb(500),Mn(400),Cd(3000),Ca(1000),Cu(32),2+2+2+Mg(2000),Al(Ó)(1000),Sb(Ó)(300),Zn(500),Fe(Ó)(10),Ni(100),Th(Ô)(7)(*表示:未做最高限检测). 第5期胡庆红,等:变色酸2B分光光度法测定蛋白质597214标准曲线及方法灵敏度按照实验方法,研究了变色酸2B与不同蛋白质的褪色反应,并以$A对不同蛋白质浓度绘制了相应标准曲线.牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶(Leso)、糜蛋白酶(Chy)、卵白蛋白(OVA)、C-球蛋白(C-G),均产生类似反应(表1).从表1可见,以上蛋白质的线性范围较宽,具有高灵敏度.并可[13]用于多种蛋白质的测定.在人血清总蛋白中主要含有HSA和C-G,从表1中的线性方程可看出,HSA和C-G的响应与选择的标准蛋白质BSA响应很接近,这是本法能准确测定血清总蛋白的重要依据.表1测定几种蛋白质的标准曲线Table1CalibrationGraphsfortheDeterminationofProteins蛋白质标准曲线线性范围(Lg/mL)相关系数(r)E(L#mol-1#cm-1)BSAA=8154@10-3C-0100340~40019991518@105HSAA=8195@10-3C-0100510~40019983611@105LesoA=7176@10-3C+0100520~40019982217@105ChyA=4133@10-3C-0101000~30019985111@105OVAA=5131@10-3C-0100060~50019967213@105C-GA=7138@10-3C-0101890~36019967112@106215人血清样品中总蛋白质量测定结果取人血清样品(西南师范大学医院提供)0115mL,于10010mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀.取上述试液115mL血清样品,按照实验方法,测定吸光度,所得结果见表2.结果表明与考马斯亮蓝(CBBG[2]-250)一致,并有较好的回收率.表2人血清样品中总蛋白质量测定结果Table2ResultsoftheDeterminationofTotalProteinsinHumanSerumSamplesCBBG-250法变色酸2B法变色酸2B回收率样品平均值RSD(%)平均值RSD(%)平均回收率RSD(%)(g/L)(n=6)(g/L)(n=6)(%)(n=6)174101187310217991521327612117751321096102113801211576162159710213参考文献:[1]DoumasBT,WatsonWA.AlbuminStandardsandtheMeasurementofSAwithBCG[J].ClinChemActa,1971,31:87.[2]BradfordMM.ARapidandSensitiveMethodfortheQuantitationofMicrogramQuantitiesofProteinUtilizingthePrincipleofProtein-dyeBinding[J].AnalBiochem.1976.72:248-254.[3]孙明洪.微量蛋白质溴酚蓝)))甲醇比色测定法[J].临床检验杂志,1994.12(1):16-17.[4]胡秋娈,李娜,赵风林,等.氯磺酚S与蛋白质作用的分光光度研究[J].分析化学,1999,27(2):166-169.[5]胡秋娈.以偶氮胂K光度法测定蛋白质[J].分析测试学报,2000,19(1):45-47.[6]FujitaY,MoriI,KitanoS.Applicationofxanthinederivativesforanalyticalchemistry.XLI.Pyrocatecholviole-tmolybdenum(Ö)complex[J].ChemPharmBull,1984,32(10):4161-4164.[7]汤桂那,魏巍,王保宁.4,5-二溴苯基荧光酮-钛(Ô)-Tween-80分光光度法测定尿蛋白[J].分析化学,1993,21(7):831-833. 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