紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性

'农业基础科学《现代农业科技》2009年第20期紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性杨兰芳庞静彭小兰闫静静（湖北大学资源环境学院，湖北武汉430062）摘要为简便快速测定植物过氧化氢酶活性，进行了紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的新方法试验。结果表明：本法操作简便，重现好，相对误差小，不需要特殊的试剂和仪器设备，适合于批量分析；利用硫酸阻止和终止酶促反应，既简化了操作，又减少了误差来源；本法的测定结果与高锰酸钾滴定法的结果呈极显著线性相关，是一种值得推广应用的测定植物过氧化氢酶活性的新方法。关键词过氧化氢酶；紫外分光光度法；植物；硫酸；高锰酸钾滴定法中图分类号Q946.8文献标识码A文章编号1007-5739（2009）20-0364-03MeasurementofCatalaseActivityinPlantsbyUltravioletSpectrophotometryYANGLan-fangPANGJingPENGXiao-lanYANJing-jing（CollegeofResourcesandEnvironmentalScience，HubeiUniversity，WuhanHubei430062）AbstractAnewmeasuringmethodbyultravioletspectrophotometrywasconductedinordertoanalyzetheactivityofcatalaseinplants.Theresultsshowedthismethodwassuitableforanalyzingsamplesinbatchesasitssimpleconvenientoperation，highreproducibility，littleerrors,nospecialandexpensivereagents，equipments.Theusageofsulfuricacidtopreventandstopthereactionnotonlysimplifiedtheoperation，butalsoreducedthesourceoferrors.Withaverysignificantlinearcorrelationbetweentheultravioletspectrophotometryandpotassiumpermanganatetitration，itprovedthatultravioletspectrophotometrywasavaluablemethodandworthpopularizingindeterminationofcatalaseactivityinplants.Keywordscatalase；ultravioletspectrophotometry；plant；sulfuricacid；potassiumpermanganatetitration过氧化氢酶是植物体内清除过氧化氢的主要酶类[1]，植标定，该溶液的浓度为0.3178mol/L1/2H，亦即5.40262O2物代谢过程会产生活性氧自由基，再转化成过氧化氢，而过mg/mLH2O2。氧化氢对植物细胞具有损伤作用[2]。过氧化氢酶的主要功能8%硫酸：吸取40mL分析纯浓硫酸缓慢加入约350mL即清除植物代谢过程产生的过氧化氢，从而对植物细胞具有蒸馏水中，冷却后定容至500mL。保护作用[3]。植物过氧化氢酶还与环境污染与胁迫[1，4]、营养高锰酸钾溶液：称取分析纯高锰酸钾（KMnO4）3.16g，溶元素缺乏[5，6]、病虫害危害有关[1，7]。研究植物过氧化氢酶，可解后定容至1000mL，其准确浓度用草酸钠标定。经标定该以认识植物的生长状况、了解植物是否受到损伤、揭示植物溶液浓度为0.0990mol/L1/5H2O2。与不良环境的关系以及为植物营养诊断提供依据。因此，探紫外分光光度计：UV-9100，北京瑞利分析仪器有限索一种简便快速的测定植物过氧化氢酶活性的方法，具有公司。重要的科学和实用价值。当前对植物过氧化氢酶活性的测定冷冻离心机：恰菲尔，GL-20B，上海恰菲尔分析仪器有方法，有的需要特殊仪器装置，有的操作和人为误差大，有限公司。的需要昂贵试剂，有的操作繁琐，都不利于批量样品分析和1.3试验方法快速测定。本试验探索利用紫外分光光度法直接测定植物过1.3.1植物过氧化氢酶提取液的制备。统一剪取大豆第3氧化氢酶活性，具有简便、快速和不需要特殊试剂和仪器的叶带回室内洗净，用吸水纸吸干水分后称重，然后放进研钵特点，对植物过氧化氢酶的研究具有重要实践意义和运用中加入3mLpH值7.8的磷酸盐缓冲溶液，加入少量石英价值。砂，在冰浴上研磨成匀浆，再加入5mL缓冲溶液研磨均匀，1材料与方法转入25mL比色管中，并用缓冲溶液少量多次洗涤研钵，洗1.1材料液并入比色管中，最后用缓冲溶液定容至刻度。摇匀后取约所用植物为大豆（GlycinemaxMerr.），在大豆结荚期采5mL溶液于离心管中，成对调节平衡后用冷冻离心机在取不同环境条件生长的大豆叶片样品6个，分别编号为S1、4℃4000g下离心10min，上清液即为过氧化氢酶提取液，S2、S3、S4、S5和S6。转入小试管中保存于4℃冰箱中备用。1.2试剂与仪器1.3.2紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性。样品测定：取磷酸盐缓冲溶液（pH值7.8）：称取65.52gNa2HPO4·小试管2支，1支做样品管，1支做对照管。在对照管里依次12H2O（分析纯）、2.66gNaH2PO4·2H2O（分析纯）、10g聚乙加1.5mL缓冲溶液、0.1mL酶提取液、0.2mL蒸馏水、1.0mL烯吡咯烷酮（PVP，分析纯），用约900mL蒸馏水溶解，检查硫酸、0.2mL过氧化氢溶液。在样品管里依次加1.5mL缓冲pH值后定容至1000mL。溶液、0.1mL酶提取液、1.2mL蒸馏水，然后加入0.2mL过过氧化氢溶液：吸取30%过氧化氢（分析纯）1.5mL，用氧化氢溶液，立即计时4min后加入1mL硫酸终止反应。然蒸馏水定容至100mL，用高锰酸钾标定其准确浓度。经过后在240nm处以蒸馏水调零，分别测定样品管与对照管的基金项目湖北省教育厅重点项目（D20091009）。吸光度。作者简介杨兰芳（1964-），男，湖北武汉人，土家族，副教授，博士，主标准曲线：取小试管6支并编号，按表1依次加完各种要从事土壤物质循环及其环境效应方面的研究。收稿日期2009-08-03试剂后摇匀，然后在240nm处以0号管调零，测定其余各管364 《现代农业科技》2009年第20期农业基础科学吸光度。表2紫外分光光度法测定大豆过氧化氢酶活性的重现性表1标准曲线的配制样品重复次数平均值标准差变异系数S1541.481.894.56缓冲溶液8%硫酸蒸馏水过氧化氢H2O2试管编号S2543.842.124.84mLmLmLmLmgS3545.092.024.4801.51.01.500S4536.151.594.4011.51.01.40.10.540S5529.541.374.6421.51.01.30.21.080S6549.762.545.1031.51.01.20.31.62141.51.01.10.42.161对上述6个样品的同一提取液利用高锰酸钾容量法测51.51.01.00.52.701定过氧化氢酶活性，与紫外分光光度法测定的酶活性相关结果计算：植物过氧化氢酶活性E（mgH2O2/min·g）=图如图2所示。可以看出，高锰酸钾容量法所测定的酶活性a（Ak-As）+b×25，其是Ak为对照的吸光度，As为样品的比紫外分光光度法高，但2种方法线性相关系数达到0.9943wt0.1（P<0.01），说明2种方法之间存在极显著线性相关。吸光度，t为反应时间（min），a、b为标准曲线回归方程中的80常数。751.3.3高锰酸钾容量法测定植物过氧化氢酶活性。取50mL70三角瓶2个，1个做样品，1个做对照。在对照瓶中，依次加性65入1mL酶提取液、1.5mL缓冲溶液、2.5mL硫酸和过氧化氢活C=1.1962x+9.519560R2=0.9996酶2.5mL。在样品瓶中依次加入1mL酶提取液、1.5mL缓冲液法55和2.5mL过氧化氢溶液后立即计时4min，加入2.5mL硫量50容酸。然后将对照和样品分别用高锰酸钾溶液滴定至紫红色45保持30s不褪色为终点。对照与样品消耗的高锰酸钾溶液体40积之差所相当的过氧化氢的量即为被酶促反应所分解的过25303540455055氧化氢的量。则植物过氧化氢酶活性为：E（mgH2O2/min·g）紫外法酶活性=Vk-Vs×C×17×25，Vk为对照所消耗的高锰酸钾的体积，图2紫外分光光度法与高锰酸钾容量法相关性wt利用样品S3的酶提取液同时用紫外分光光度法和高Vs为样品所消耗的高锰酸钾体积，c为高锰酸钾的浓度（mol锰酸钾容量法各做5次重复测定，结果如表3所示。可以看1/5KMnO4），17为1mol1/5KMnO4所相当的过氧化氢的毫出，紫外分光光度法的酶活性低于高锰酸钾容量法，但是紫克数。外分光光度法的变异系数比高锰酸钾容量法略小，说明紫外2结果与分析分光光度法的重现性优于或与高锰酸钾容量法相当。2.1吸光度与过氧化氢数量的关系将所测定的标准系列进行回归分析（图1）。可看以出，表3同一样品2种方法的重现性比较过氧化氢的毫克数C与吸光度A之间呈极显著的线性相过氧化氢酶活性测定方法重复次数平均值标准差变异系数关，其相关系数达到0.9996，说明在240nm下利用紫外分紫外分光光度法545.092.024.48光光度法进行溶液中过氧化氢的定量分析是可行的。高锰酸钾容量法563.543.285.163.03讨论2.5植物过氧化氢酶是植物的抗氧化酶类，对植物细胞具g2.0有抗氧化损伤的保护作用。因此，测定植物过氧化氢酶活m∥性可以认识植物是否受到损伤，揭示植物对环境的响应。21.5O2测定植物过氧化氢酶活性的方法有紫外速率法、高锰酸钾HC=3.3799A+0.02681.0滴定法、碘量滴定法、氧电极法、分光光度法、气量法等[8-12]。r=0.99960.5用紫外分光光度法直接沉淀测定植物过氧化氢酶活性的方法尚未见报道。虽然紫外速率法也是在240nm下测定吸000.20.40.60.81.0光度[8，10]，但它是测定吸光度的变化速率，一方面需要在一吸光度定时间内多次读数，操作记录时容易出错，另一方面用吸图1吸光度与过氧化氢量的关系光度的变化率表示酶的活性，只是相对活性，不便于不同2.2方法的重现性高锰酸钾滴定法比较。陈晓敏[13]利用紫外分光光度法直接对所取的6个样品按紫外分光光度法测定其过氧化氢测定过氧化氢含量来测定植物过氧化氢酶活性，但其所用酶活性，每个样品重复测定5次，所得结果见表2。可以看波长是290nm，而该吸收峰下对过氧化氢灵敏度不如240出，6个样品所测定的过氧化氢酶活性的变异系数在4.4%~[14]也研究利用紫外分光光度法测定植nm处高。王春台等5.1%之间，表明该方法的测定误差较小，重现性较高。物过氧化氢酶活性，但他们是根据碘量滴定的原理，在3502.3紫外分光光度法与高锰酸钾容量法的相关性[11]可见分光光度法测定过nm下测定碘的浓度。胡常英等365 农业基础科学《现代农业科技》2009年第20期氧化氢酶活性，但需要利用过氧化物酶等特殊试剂，试剂既可减少误差，简化操作，又能稳定溶液中的过氧化氢。昂贵且不容易购买。气量法需要特殊装置，不便于批量分（4）紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性操作简析，氧电极法的重现性不稳定。本试验利用紫外分光光度单、重现性较好，与高锰酸钾呈极显著的线性相关，可用于法在240nm下直接测定溶液过氧化氢的浓度来测定植物植物过氧化氢酶活性的测定。过氧化氢酶活性，与常用的高锰酸钾滴定法相比具有操作5参考文献简单、快速、重现性与高锰酸钾滴定该相当的优点，同其他[1]WITLEKENSH，INZ魪D，VANMONTAGUM，etal.Catalasesinpla-nts.MolecularBreeding，1995（1）：207-228方法相比具有不需要特殊试剂的优点，可以用于测定植物[2]SHIMIS，MOMOSEY，YAMAMOTOA，etal.Inhibitionofcatalase过氧化氢酶活性。本试验结果表明，运用紫外分光光度法activitybyoxidativestressanditsrelationshiptosalicylicacidaccumula-测定的同一样品的过氧化氢酶活性低于高锰酸钾滴定法，tioninplants[J].PlantGrowthRegulation，2003（39）：285-292.[3]刘冰，梁婵娟.生物过氧化氢酶研究进展[J].中国农学通报，2005，21其主要原因是在滴定过程中，由于提取液可溶性有机物的（5）：223-225影响，近终点容易褪色，使得滴定终点不好控制，但2种方[4]王丽红，黄晓华，周青.水稻、小麦和油菜种子萌发POD与CAT对法的测定结果呈极显著的线性相关，表明紫外分光光度法酸雨胁迫的响应[J].环境科学，2005，26（6）：123-125[5]张耀栋，陈春宏，高祖民，等.应用过氧化氢酶活性对水培叶菜缺铁测定植物过氧化氢酶活性是可行的。本试验中运用8%硫诊断初探[J].南京农业大学学报，1993，16（1）：60-64酸来终止酶促反应，对照采用先加酸后再加基质过氧化[6]RIOLAD，GOMEZM，YA譙EZJ，etal.Irondeficiencyinpeaplantseffectoncatalase，peroxidase，chlorophyllandproteinsofleaves[J].Plant氢，而没有采用一般方法中的加热煮沸使酶失活，这样既andSoil，1978（49）：343-353.保持对照和样品基体的一致性，又简化了操作过程，还避[7]MEDHYMC.Activeoxygenspeciesinplantdefenseagainstpathogens免了加热带来的误差。因为在试验中发现加热煮沸使酶失[J].PlantPhysiol，1994（105）：467-472.[8]王学奎.植物生理生化试验原理和技术[M].北京：高等教育出版社活时，溶液中蛋白质会因热变性而产生沉淀，导致很大的（第二版），2006.吸光度误差。所以硫酸不仅能阻止和终止酶促反应，还能[9]郝建军，康宗利，于洋.植物生理试验技术[M].北京：化学工业出版稳定过氧化氢。社，2007.[10]李仕飞，刘世同，周建平，等.分光光度法测定植物过氧化氢酶活性4结论的研究[J].安徽农学通报，2007，13（2）：72-73.（1）在240nm下，溶液吸光度与过氧化氢毫克数之间呈[11]胡常英，刘丽娜，胡凤英，等.用721-分光光度计测定过氧化氢酶活性的新方法[J].中国食品添加剂，2005（6）：116-118.极显著的线性相关，证明可以用紫外分光光度法进行溶液[12]张宝元，靳卫东.过氧化氢酶活性的定量测定[J].科学教育，2007，13中过氧化氢的定量分析。（4）：56-57.（2）紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的变异[13]陈晓敏.测定切花中过氧化氢酶活性的3种方法的比较[J]热带农业科学，2002，22（5）：13-16.系数在5.1%的以下，说明该方法重现性好，相对误差小。[14]王春台，徐同，刘学群.紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性[J].华（3）在对照和样品中利用硫酸来阻止和终止酶促反应，中农业大学学报，1987，6（1）：77-81.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第362页）历史上茶艺服装的发展感兴趣；植物保护专业的学生，可化素质，所以在4个方面内容都讲授的基础上，重点讲授茶能对历史上茶园管理的发展感兴趣；法律专业的学生，可文化史。能对历史上的茶叶法规感兴趣；经济学专业的学生，可能从学时和学期安排上可以明显看出，茶学专业研究生对茶叶经济贸易感兴趣；外国语专业的学生，可能对茶叶需要全面而深入的掌握茶叶历史知识。因此，可以在上学期对外传播感兴趣；中文专业的学生，可能对茶文学作品的讲授茶文化史、茶传播史，下学期讲授茶科技史、茶经济史，历史发展感兴趣等等。因此，可以要求其他专业本科生，结在内容深度上，对重要的茶叶历史问题要展开深入的分析，合自己所学专业以及兴趣爱好，写作有关茶叶历史课程内对不同的学术观点要进行科学的探讨，以培养研究生的学容的论文。而对于茶学专业研究生，必须要求所写课程论文具有术素养。一定的深度，不能只是泛泛而谈，应该针对某一个茶叶历史4关于茶叶历史课程的考核方式问题，进行较为深入的分析与讨论，要有理有据地提出自己课程教学临近结束时，就进入考核环节。针对不同的教的观点，以达到培养学生学术素养的教学目标。学对象，需要采取相应的考核方式。对茶艺专业高职学生、5参考文献茶学专业本科生，适宜采取闭卷考试的方式，以促进学生记[1]章传政，丁以寿，夏涛.关于茶艺教育招生问题的探讨[J].现代农业科忆并掌握所学知识点。对其他专业本科生、茶学专业研究生，技，2009（8）：260.适宜采取写作课程论文的方式。不过，同为写作课程论文，[2]夏涛.中华茶史[M].合肥：安徽教育出版社，2008.[3]陈椽.茶业通史[M].北京：农业出版社，1984.但是对课程论文的要求是不同的。[4]朱红缨.基于专业教育的茶文化学体系研究[J].茶叶科学，2006（1）：其他专业本科生，比如服装设计专业的学生，可能对42-48.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第363页）现代化，2008（5）：282-283.[2]莫晓凤.刍议生物物种咨源出入境查验[J].中国检验检疫，2009（9）：动态变化，保障生物物种资源安全、生态环境安全、促进生15-16.物物种资源持续快速协调健康发展。[3]绿报.我国外来生物入侵形势严峻[J].湖南林业，2007（2）：39.3参考文献[4]季生敏.对大兴安岭林区生物多样性保护的探讨[J].民营科技，2009[1]李庆年，申相德.加快产权制度创新防止我国物种资源流失[J].商场（3）：83.366'