分光光度法快速检测细菌_李冬阳

'第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第4期2010年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry573～576DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00573分光光度法快速检测细菌*李冬阳茹柿平吴坚应义斌(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310029)摘要采用分光光度法来检测完整细胞内H2O2酶的活性，以实现细菌的快速检测。由于细菌(本研究以E.coliDH5α为模型)内含有H2O2酶，当往菌液中加入H2O2时，H2O2会在胞内H2O2酶的作用下分解，其分解过程遵循一级动力学反应。通过测量该反应中H2O2在240nm处吸光度的变化，可以得出该一级反应的－13速率常数，从而获悉菌液的浓度。结果表明:大肠杆菌单位细胞浓度酶活为4.2×10L/(s·cell)，其速率676常数与浓度在5.7×10～5.7×10cfu/mL范围内呈现良好的线性关系，检出限为5.7×10cfu/mL。本方法是一种检测细菌总数的快速方法，测试时间为5～10min。关键词细菌检测;过氧化氢酶;酶活性;分光光度法;生物传感器1引言摄入含有细菌或细菌毒素的食品会引起细菌性食物中毒。美国疾控中心(CDC)估计，美国每年食［1］源性致病菌的病例约7600万，其中5200例死亡。1999～2000年，在我国东部部分地区发生了较大［2］规模的E.coliOl57∶H7爆发，对我国经济造成了重大损失。解决由细菌性中毒引发的食品安全问题尤为紧迫。然而，由于目前检测手段普遍存在耗时长、操作复杂和成本高等问题，严重制约了食品安全监控技术和管理体系的完善及实际运行。因此，建立和推广准确、快速和低成本的细菌检测技术很有必要。目前，快速检测细菌的技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附(ELISA)和生物传感［3，4］［5］器等。PCR技术灵敏度高，相对耗时短，但对操作人员的技术要求较高。ELISA技术较为成熟，但成本较高，用于显色的苯类有机试剂易对人和环境造成不利影响。生物传感器作为一种新兴技术，以其检测快速而闻名，但由于其构成涉及敏感的生物材料，稳定性和重复性问题，严重影响着这项技术投入［6］［7］量产。近年来，通过检测样品中与细胞浓度成正比的细胞内含物(如ATP和酶)来快速监测细菌已引起了广泛关注。酶中以监测H2O2酶(Catalase)的活性来检测细菌的研究最多。由于H2O2酶会催化分解H2O2而产生氧气和水，检测H2O2酶的活性需监测反应中产物(O2)的增加或反应物(H2O2)的减［8］［9］少。目前，通过监测H2O2来测过氧化酶活性的方法主要有滴定法、形成中间产物比色法、化学发［`10］［11］［12］［13］光法、荧光法、电化学法和分光光度法。其中电化学法和分光光度法最为简便，它们不仅可以实现实时监测，也无需引入额外的试剂。电化学法因电极易受样品污染等因素导致其稳定性和重复性较差;分光光度法灵敏度相对要低，但稳定性好。分光光度法的应用多限于对纯酶的研究，且通过间隔(Stop-watch)手动测吸光值来研究动力学过程，尚未见将该法用于完整细胞H2O2酶活测试的报道。本研究采用分光光度计法的动力学实时测量模式来监测与完整细胞作用时H2O2的变化，并以此测定酶活性，建立了定量测试细菌浓度的方法。2实验部分2.1仪器与试剂2550紫外分光光度计(日本岛津公司);Ⅱ级生物安全柜(新加坡ESCO公司);高速冷冻离心机(德国SOVALL公司);SPX-250智能生化培养箱(赛福公司);全自动灭菌锅(台湾浩翰公司);SK3300HP超声清洗器(科导公司);BS224型电子天平(德国Sartorius公司);数据分析采用Origin软件。2009-08-10收稿;2009-12-02接受本文受教育部新世纪人才项目(No.NCET-07-0725)、浙江省重点科技项目(No.2008C14077)和国家科技专项(No.2009ZX08012-004B)资助*E-mail:wujian69@zju.edu.cn 574分析化学第38卷LB培养基，10mmol/LPBS缓冲液(pH7.4)，30%H2O2溶液(国药集团)，所用试剂均为分析级以上;实验用水通过去离子水机(法国Millipore公司)制备。2.2实验方法2.2.1大肠杆菌的培养与计数大肠杆菌E.coliDH5α由浙江大学食品系提供。用LB培养基在37℃条件下培养24h，在4℃、8000g条件下离心15min，取出上清液，将菌泥再用PBS悬浮，之后再离心(5min)和悬浮两次以确保得到将培养基冲洗干净的细菌悬浮液。取0.1mL所得菌液进行梯度稀释，采用传统的平板计数法计数。将其余的菌液稀释得到不同浓度待测菌液样品。为方便表示，将离心后所得到的E.coli菌原液浓度定义为E［0］，意为0倍稀释;其逐步倍比稀释得到0.5E［0］，0.25E［0］，0.125E［0］;将菌原液进行6个梯度的稀释得E［-1］，E［-2］，E［-3］，E［-4］，E［-5］和E［-6］，其倍比稀释后的表示方法与E［0］类似。2.2.2H2O2检测波长的选择以去离子水为参比，对不同浓度梯度H2O2(0.01～1mol/L)进行波长扫描(200～350nm)，确定最佳检测波长240nm;在此波长下，测试不同浓度的H2O2的吸光度。2.2.3不同浓度的细菌与H2O2作用的动力学实验分别在不同浓度的菌液中加入H2O2(最终浓度3为10mmol/L);由于浓度超过10cfu/mL的菌液都有较强的背景吸收，需用合适的参比消除背景干扰，其参比和样品配制见表1。表1不同浓度的细菌与H2O2作用时的空白和样品组成Table1CompositionofblankandsamplewhenbacteriaofdifferentconcentrationsactwithH2O2连续移液至比色皿空白池样品池测试液中的浓度PipettesuccesivelyintothecuvetteBlankSampleConcentrationinassaymixturePBS1.00mL－PBS10mmol/L样品(菌液)Sample(bacteriasolution)2.00mL2.00mL0.67(V/V)H2O2(30mmol/L)－1.00mLH2O210mmol/L加入H2O2，反应即刻开始;初始的吸光值应接近于0.5;记录吸光值下降过程300s(StartthereactionbyadditionofH2O2;followthedecreaseinabsorbancewitharecorderfor300s)。3结果与讨论3.1H2O2的光谱特性由于H2O2酶-H2O2反应的产物为O2和H2O，这两者在紫外波段都没有光吸收，因此，H2O2的紫外吸收可以直接表征该酶反应体系中H2O2的浓度。0.01～1.0mol/LH2O2在350～200nm的波长扫描光谱如图1所示，H2O2的吸光度随波长的减小而增大。Beers等选取了240nm研究H2O2酶-H2O2［13］反应中不同浓度的H2O2酶的动力学曲线;考虑到Beers法在测酶活性方面的广泛应用、紫外段仪器光源的稳定性和200nm附近菌液的干扰吸收增大，本研究选用240nm为H2O2检测波长，10mmol/L为［14］起始H2O2浓度。在该波长下，H2O2吸光度随浓度变化的曲线如图1中插图所示。3.2H2O2和大肠杆菌在240nm处的稳定性分别记录10mmol/LH2O2以及不同浓度的菌液在240nm处的吸光值随时间变化的响应曲线，发现10min内吸光度变化小于0.004，相比于0～1吸光度范围内仪器自身测光准确度(±0.002～0.004)可知，H2O2和大肠杆菌在240nm波长照射下非常稳定。图1不同浓度的H2O2波长扫描图谱3.3不同浓度的细菌与H2O2作用的动力学Fig.1Wavelength-scanspectrogramofH2O2with对于一级反应有如下关系式:differentconcentrations－dc/dt=kc(1) 第4期李冬阳等:分光光度法快速检测细菌575式(1)积分整理后得:c=c0exp(－kt)(2)［15］式(2)表示了一级反应中的反应物浓度随时间变化的规律。若以lnc对时间t作图应得到一条直线，而直线斜率的负值就是反应速率常数k。由Lambert-Beer定律有A=εbc，可知(2)式还可以表述为:A=A0exp(－kt)(3)［14］H2O2酶催化分解H2O2的反应为一级反应，其活性最佳pH范围为6.8～7.5。本研究中采用pH7.4的PBS缓冲液为测试工作液。图2为10mmol/LH2O2与不同浓度的细菌作用时的动力学曲线7(菌原液的浓度E［0］为5.7×10cfu/mL)，将所得曲线用两种方法进行数据处理来计算酶活。［10］［16］方法一:以速率常数k表示酶活性。用方程y=y0+A0exp(－kx)进行拟合。图2以菌原液E［0］为例，其拟合线与实测线的重合性良好，最终拟合出的方程为y=0.0307+0.35781exp(－0.01629x)，2R=0.97565。这表明完整细胞(Intactcell)内H2O2酶与H2O2的作用仍遵循一级反应。按同样的拟合方2法，得到各个菌液浓度下的速率常数k值和相关性R值(表2)，以k值对细菌浓度作图得到图3，可见，2k与细菌浓度之间呈现良好的线性相关性，R=0.98573。另外，以单位细胞浓度酶活性K′(k/C)表征不同完整细胞的酶活性，不同于传统的以转换数(Specificactivity，单位纯酶重量或酶蛋白量的速率常数值)。在测得未知样品酶活的情况下，可以用K′计数细菌浓度量，在细菌检测中更有实际意义。不同种细胞之间－13的酶含量和活性不同，本研究中大肠肝菌的单位细胞浓度酶活K′=4.2×10L/(scell)。图2不同浓度的菌液与10mmol/LH2O2作用的动力图3菌液浓度与速率常数k的关系学曲线(240nm)Fig.3RelationshipbetweenE.coliconcentrationsandFig.2KineticcurvesofE.coliwithdifferentconcentra-correspondingrateconstantktionreactingwithH2O2表2细菌浓度和拟合所得的H2O2酶速率常数Table2BacteriaconcentrationCvaluesandcorrespondingcatalasekvaluesfitted浓度Concentration27kR(5.7×10cfu/mL)10.016340.975650.50.008460.997750.250.005740.996630.1250.002420.993480.10.001410.99800.050.001590.99470.0250.0001910.99610.01250.0004960.8604图4菌液浓度与吸光度变化值ΔA的关系Fig.4RelationshipbetweenE.coliconcentrations方法二:用单位时间内H2O2吸光值的变化表征酶andcorrespondingΔA［14］的活性。本研究将各浓度菌液的H2O2酶活值按0～5min内吸光度的变化ΔΑ(A－A0)表示，以ΔA2对浓度作图得到图4。可见，ΔA与细菌浓度之间呈现良好的线性关系，R=0.95163。方法二的优点在 576分析化学第38卷于简便易操作，但无法得知该反应是否为一级反应，因为有可能有其它反应混入或混级反应发生，易造成误差。只有在反应确实为一级反应的情况下方法二才能准确，这也是方法一有更好的线性相关性的原因。本研究的对象为完整细胞中的酶，而非提取物或纯化酶。由于完整细胞的有机体结构完好，对胞内酶有更好地保护，酶相对更难以失活，这也是本研究中测试时间为5min时反应仍遵循一级反应动力学而未出现酶失活的原因。将监测时间延长到10min时，所测的动力学曲线用方法一拟合后拟合度仍很高，说明10min时完整细胞内的活性基本稳定，未钝化(数据未给出)。这为提高该法的灵敏度提供了可能，因为测试时间越长，反应越充分，信号响应的积累越大，方法的灵敏度更高。References1MeadPS，SlutskerL.EmergInfectDis，1999，5(5):607～6252LIDu-Juan(李杜娟)，WANGJian-Ping(王剑平)，YINGYi-Bin(应义斌)，LIYan-Bin(李延斌).ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology(中国生物化学与分子生物学报)，2007，23(3):194～1993LIDu-Juan(李杜娟)，WANGJian-Ping(王剑平)，GELin(盖玲)，YINGYi-Bin(应义斌).ChineseJournalofSensorsandActuators(传感技术学报)，2008，21(5):709～7144LUOJin-Ping(罗金平)，TIANQing(田青)，YUEWei-Wei(岳伟伟)，HEBao-Shan(何保山)，CAIXin-Xia(蔡新霞).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学)，2009，37(2):306～3105LazckaO，DelCampoFJ，MunozFX.Biosen.Bioelectron，2007，22(7):1205～12176QiuJ，ZhouY，ChenH，LinJM.Talanta，2009，79(3):787～7957TomasLAL，OrdonezJA，deFernandoGG.Meat.Sci.，2006，72(2):222～2288BonnichsenRK.MethodsEnzymol.，1955，2:7819CohenG，DembiecD，MarcusJ.Anal.Biochem.，1970，34(1):30～3810MuellerS，RiedelHD，StremmelW.Anal.Biochem.，1997，245(1):55～6011WuM，LinZ，WolfbeisO.Anal.Biochem.，2003，320(1):129～13512LiuXP，ZweierJL.FreeRadic.Biol.Med.，2001，31(7):894～90113BeersRF，SizerIW.J.Biol.Chem.，1952，195(1):133～14014AebiH.MethodsEnzymol.，1984，105:121～12615WANGJing-Yan(王镜岩)，ZHUShen-Gen(朱圣庚)，XUChang-Fa(徐长法).Biochemistry(生物化学).3rdEd(第三版).Beijing(北京):HigherEducationPress(高等教育出版社)，2002:35316DavisonAJ，KettleAJ，FaturDJ.J.Biol.Chem.，1986，261(3):1193～1200SpectrophotometricMethodforRapidDetectionofBacteria*LIDong-Yang，RUShi-Ping，WUJian，YINGYi-Bin(CollegeofBiosystemEngineeringandFoodScience，ZhejiangUniversity，Hangzhou310029)AbstractThecatalaseactivityofintactcellswasinvestigatedwiththeUVspectrophotometrytorealizetherapiddetectionforbacteria(E.coliDH5αasamodel).Withtheadditionofhydrogenperoxidetothebacteriasolution，thecatalaseofthebacteriawoulddecomposethehydrogenperoxide，whichfollowedthefirst-orderkinetic.Thefirst-orderrateconstantthatreflectedthebacteriaconcentrationwascalculatedaccordingtotheabsorbancechangeofhydrogenperoxideat240nm.Theresultsindicatedthattherewasalinearrelationship67betweentherateconstantandtheE.coliconcentrationintherangeof5.7×10－5.7×10cfu/mL;thecata-－13laseactivityofintactE.coliwas4.2×10L/(s·cell).Thismethodcouldbeusedtodetectthebacteria6of5.7×10cfu/mLwithin5－10min.KeywordsBacteriadetection;Catalase;Enzymeactivity;Spectrophotometry;Biosensor(Received10August2009;accepted2December2009)'