分光光度法测定高浓度培养液下的产油酵母菌生长曲线

'·生物技术·北方园艺２０１３（０８）：１１６～１１８分光光度法测定高浓度培养液下的产油酵母菌生长曲线马勇，图雅，陈秀莉，门中华（包头师范学院生物科学与技术学院，内蒙古包头０１４０３０）摘要：采用分光光度法测定酵母菌不同生长时间高浓度培养液的ＯＤ６００值，并对不同生长时间高浓度培养液进行相应倍数的稀释，使用建立ＯＤ６００值回归方程的方法，利用回归后的ＯＤ６００值绘制出产油酵母菌Ｙ１的生长曲线。结果表明：所得到的生长曲线可以准确反应菌体的生长规律。酵母菌Ｙ１在适宜生长条件下菌体细胞生长出现４个阶段：延滞期、对数期、稳定期和衰亡期，其中，０～４ｈ为延滞期，４～２４ｈ为对数生长期，２４～６８ｈ为稳定期，６８ｈ以后进入衰亡期。该研究旨在为相关研究人员提供类似问题的详细解决办法和重要参考。关键词：产油酵母；分光光度法；生长曲线；回归方程中图分类号：Ｑ９４３．１文献标识码：Ａ文章编号：１００１－０００９（２０１３）０８－０１１６－０３我国人均石化资源贮量十分有限，而能源需求量却光度法测定酵母菌不同生长时间高浓度培养液的ＯＤ６００与日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的值，并对不同生长时间高浓度培养液进行相应倍数的［１］潜在油源。由微生物生产富含多种生理功能的不饱稀释，使得稀释后的培养液所测得的ＯＤ６００值均保持在［３］和脂肪酸油脂已引起国内外的广泛重视。因此，微生物０．１～０．８之间，然后建立相关稀释倍数间的ＯＤ６００值［２］油脂的研究将成为新世纪油脂工业的一个发展方向。回归方程，使所有实际测得的ＯＤ６００值均回归到同一稀在进行产油酵母的研究中，能够准确测定所使用菌种的释倍数所表现的回归后ＯＤ６００值，最终确定了其生长生长量以及后期测定所用菌种的生长曲线，对于了解所曲线。用菌种以及后期的发酵产脂培养是十分重要的一项生１材料与方法［３］理指标。生长曲线反映了酵母菌在培养过程中的生１．１试验材料长和繁殖的规律，同一种酵母菌因研究方法不同其生长供试菌种为产油酵母菌Ｙ１，由包头师范学院生物［３］曲线也不一样。通过测定酵母菌的生长曲线，了解其科学与技术学院实验中心保藏。生长繁殖规律，这对根据不同的需要，有效地利用和控培养基：ＹＥＰＤ液体培养基（ｇ／Ｌ）：１Ｌ培养基中含［４］制酵母菌的生长具有重要的意义。葡萄糖２０ｇ，酵母粉１０ｇ，蛋白胨１０ｇ；液体种子培养基该研究对实验室保藏的１株产油酵母菌，通过分光（ｇ／Ｌ）：１Ｌ培养基中含葡萄糖２０ｇ，（ＮＨ），４２ＳＯ４５ｇＫＨ２ＰＯ４１ｇ，酵母粉０．５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ。第一作者简介：马勇（１９８０－），男，辽宁台安人，在读博士，实验师，１．２试验方法现主要从事微生物油脂及植物生理与农作物基因工程等研究１．２．１酵母菌Ｙ１种子液的培养取活化后斜面酵母工作。菌Ｙ１一环，接种于１００ｍＬ液体ＹＥＰＤ培养基中，２８℃责任作者：门中华（１９７５－），男，内蒙古包头人，博士，副教授，硕士１８０ｒ／ｍｉｎ培养１４ｈ，备用。生导师，现主要从事植物生理生态学及分子生物学等研究工作。基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１１６０２５４）；包头师范学院１．２．２酵母菌Ｙ１不同生长时间培养液收集取２０个青年科学研究基金资助项目（ＢＳＹＫＪ２０１１－１７）。１００ｍＬ已灭菌的三角瓶分别装入２５ｍＬ液体种子培养收稿日期：２０１２－１２－１３基，标签编号，其中１个标注为ＣＫ，另外将１９个三角瓶ｗａｓＭＳｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ６ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ，４．０ｇ／Ｌａｇａｒｐｏｗｄｅｒａｎｄ１０ｇ／Ｌｍａｎｎｉｔｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ２．０ｍｇ／ＬＣＣＣ，２．０ｍｇ／ＬＰＰ３３３ａｎｄ２．０ｍｇ／ＬＡＢＡ，ｉｎａｎｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄｃｈａｍｂｒｕｎｄｅｒ１４～１６ｈｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｏｆ１５００ｌｘｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｔ２０℃，ｍｏｒｅｔｈａｎ５０％ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｍａｔｅｒｉａｌｓｕｒｖｉｖｅｄａｆｔｅｒ３００ｄａｙｓ，ｍｏｓｔｏｆｔｈｅｍｃｏｕｌｄｇｒｅｗｗｅｌｌｏｎｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒｍａｉｎｔａｉｎｅｄｓｔａｂｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＺｉｎｇｉｂｅｒｏｆｆｉｃｉｎａｌｅＲｏｓｃ．；ｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅ；ｉｎｖｉｔｒｏｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｇｒｏｗｔｈｒｅｃｏｖｅｒｙ；ｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙ１１６ 北方园艺２０１３（０８）：１１６～１１８·生物技术·从０～７２ｈ，每间隔４ｈ，分别标明培养时间。分别向已过程中共做５次稀释，稀释倍数分别为２、１０、２０、３０、５０，装入液体种子培养基的三角瓶中接入上述培养液因此需要建立４组相应稀释倍数间的ＯＤ６００值回归０．１ｍＬ，震荡摇匀后，将ＣＫ和０的２个三角瓶取出，立方程。即放入４℃冰箱贮存。将其余已接入培养液的１８个三２．２酵母菌Ｙ１不同生长时间菌悬液ＯＤ值测定回归角瓶于２８℃１８０ｒ／ｍｉｎ震荡培养，以后每隔４ｈ后取出方程的建立三角瓶，测定该瓶中的菌悬液ＯＤ。分别测定酵母菌Ｙ１培养液在１２、１６、２０、２４、２８ｈ稀１．２．３酵母菌Ｙ１不同生长时间菌悬液ＯＤ值测定释相应倍数后的ＯＤ６００值。由表２可知，随着菌体培养以无菌的液体种子培养基作为空白对照，调节仪器０位时间的增加，在同一培养时间但不同稀释倍数的菌悬液和透光率１００％。用１ｃｍ比色杯，加入未接种的ＣＫ样中测定２组ＯＤ６００值，所测得数值均在合理范围之内，可品调仪器０位。在６００ｎｍ波长下测定酵母菌Ｙ１不同用于回归方程系数的计算。生长时间培养液的ＯＤ６００值，每份样品测定３次取其平表２酵母菌Ｙ１不同稀释倍数培养液的ＯＤ６００值均值。若菌悬液太浓，应适当稀释，使ＯＤ值在０．１～０．８Ｔａｂｌｅ２ＯＤ６００ｖａｌｕｅｏｆｙｅａｓｔＹ１ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎ之间，并记录相应培养液全部培养时间、稀释倍数、培养时间／ｈ平均ＯＤ值（稀释倍数）１２１．３１１（０）ＯＤ６００值。１２０．２５６（１０）１．２．４酵母菌Ｙ１不同生长时间菌悬液ＯＤ值测定回１６１．６２１（０）归方程的建立对于较浓的培养液，在做适当稀释测１６０．４２７（１０）得ＯＤ６００值后，需补测在同一稀释倍数区间内的任意２１６０．２２７（２０）２００．５９６（１０）组ＯＤ６００值在下一稀释倍数区间内被稀释到此稀释倍２００．３１３（２０）数时的ＯＤ６００值，每份样品测定３次取其平均值。设酵２００．２０４（３０）母菌Ｙ１培养液不同稀释倍数间的ＯＤ６００值回归方程２４０．３８２（２０）［５］２４０．２３５（３０）为ｙ＝ａｘ＋ｂ（ｘ为相同培养时间培养液稀释后的２４０．１２１（５０）ＯＤ６００值，ｙ为相同培养时间培养液稀释前的ＯＤ６００值），２８０．３０７（３０）通过解得ａ、ｂ值后得到不同稀释倍数间的ＯＤ６００值回归２８０．１９１（５０）方程。然后将相应的ＯＤ６００值带入相关回归方程后得到将表２中数据代入ｙ＝ａｘ＋ｂ可得培养液相应稀释同一稀释倍数水平上的回归后所有ＯＤ６００值，以培养时倍数间的ＯＤ６００值回归方程。由表３可知，随着菌体生间为横坐标，以回归后与培养时间对应的ＯＤ６００值作为长时间的增加，菌体培养液分别被稀释１０、２０、３０、５０倍纵坐标，绘制酵母菌Ｙ１的生长曲线。时，每个稀释倍数由低到高的ＯＤ６００值回归方程分别为２结果与分析ｙ＝１．８１２９ｘ＋０．８４６９、ｙ＝１．９６５１ｘ－０．０１９０、ｙ＝２．２２５８ｘ－０．１４１１、ｙ＝１．０２８６ｘ＋０．１１０５。２．１酵母菌Ｙ１不同生长时间培养液的ＯＤ６００值表３酵母菌Ｙ１不同稀释倍数间的由表１可知，测定酵母菌Ｙ１不同生长时间培养液ＯＤ６００值回归方程表１酵母菌Ｙ１不同生长时间培养液的ＯＤ６００值Ｔａｂｌｅ３ＲｅｇｒｅｓｓｉｖｅｅｑｕａｔｉｏｎｓｏｆＯＤ６００ａｂｏｕｔＴａｂｌｅ１ＯＤ６００ｖａｌｕｅｏｆｙｅａｓｔＹ１ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｔｉｍｅｙｅａｓｔＹ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎ培养时间／ｈ平均ＯＤ６００值（稀释倍数）培养液稀释倍数ＯＤ６００值回归方程００．１０６（０）０～１０ｙ＝１．８１２９ｘ＋０．８４６９４０．３８７（０）８０．７９１（２）１０～２０ｙ＝１．９６５１ｘ－０．０１９０１２０．２１９（１０）２０～３０ｙ＝２．２２５８ｘ－０．１４１１１６０．５６８（１０）３０～５０ｙ＝１．０２８６ｘ＋０．１１０５２００．４７３（２０）２４０．３５５（３０）２．３酵母菌Ｙ１生长曲线的绘制２８０．２３９（５０）将相应稀释倍数的菌体培养液ＯＤ６００值带入对应回３２０．２６１（５０）３６０．２６５（５０）归方程后得到同一稀释倍数水平上的回归后所有ＯＤ６００４００．２７９（５０）值。由表４可知，菌体在培养过程中每４ｈ取样，培养液４４０．２８４（５０）４８０．３１２（５０）经相对应回归方程后得到回归后ＯＤ６００值，其数值能够５２０．３１５（５０）准确的体现该菌体的生长规律。５６０．３２７（５０）６００．３３０（５０）以培养时间为横坐标，以表４中ＯＤ６００回归值作为６４０．３５４（５０）纵坐标，绘制酵母菌Ｙ１的生长曲线。由图１可知，酵母６８０．３４７（５０）７２０．３４１（５０）菌Ｙ１在适宜生长条件下菌体细胞生长出现４个阶段：１１７ ·生物技术·北方园艺２０１３（０８）：１１６～１１８表４酵母菌Ｙ１不同生长时间培养液的延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。其中，０～４ｈ为延滞ＯＤ６００回归值期，为菌体适应培养液中营养成分和菌体自身调整阶Ｔａｂｌｅ４ＡｖｅｒａｇｅｒｅｇｒｅｓｓｅｄｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｅＯＤ６００ａｂｏｕｔ段；４～２４ｈ为对数生长期，２４～６８ｈ为稳定期，但在此ｙｅａｓｔＹ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｔｉｍｅｉｎｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍ期间菌体数量还略有增加；６８ｈ以后进入衰亡期，菌体培养时间／ｈ平均ＯＤ值数量开始出现下降。００．１０６４０．３８７３结论８０．７９１通过分光光度法测定酵母菌不同生长时间高浓度１２１．２４４１６１．８７７培养液的ＯＤ６００值，并对不同生长时间高浓度培养液进２０２．４９８行相应倍数的稀释，建立了４组相关稀释倍数间的２４３．１２５２８３．１３５ＯＤ６００值回归方程，并利用回归后的ＯＤ６００值获得酵母菌３２３．３１５Ｙ１的生长曲线。试验结果表明，酵母菌Ｙ１在适宜生长３６３．３４７条件下菌体细胞生长出现４个阶段：延滞期、对数期、稳４０３．４６２４４３．５０２定期和衰亡期，其中，０～４ｈ为延滞期，４～２４ｈ为对数４８３．７３０生长期，２４～６８ｈ为稳定期，６８ｈ以后进入衰亡期。５２３．７５５参考文献５６３．８５３６０３．８７７［１］ＬｉＱ，ＤｕＷ，ＬｉｕＤＨ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｏｉｌｓｆｏｒｂｉｏｄｉｅｓｅｌ６４４．０７３ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８０：７４９－７５６．６８４．０１６［２］杜凯，孙晓璐．发酵性丝孢酵母发酵产油脂的碳源和氮源选择［Ｊ］．７２３．９６８中国油脂，２０１０（７）：３５－３７．［３］陶令霞，夏铁骑，常慧萍．两种测定固氮菌ＮＴ０６菌株生长曲线方法的比较［Ｊ］．生物学杂志，２００７（５）：５７－５８．［４］ＫａｍｉｓａｋａＹ，ＮｏｄａＮ，ＳａｋａｉＴ，ｅｔａｌ．Ｌｉｐｉｄｂｏｄｉｅｓａｎｄｌｉｐｉｄｂｏｄｙｆｏｒｍａ－ｔｉｏｎｉｎａｎｏｌｅａｇｉｎｏｕｓｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｒａｍａｎｎｉａｎａｖａｒ．ａｎｇｕｌｉｓｐｏｒａ，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９９，１４３８（２）：１８５－１９８．［５］李学贵，袁生．微生物转化过程中利用ＯＤ值实时监测细菌生物量变化的研究［Ｊ］．南京师大学报，２００３（４）：９２－９３．［６］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．３版．北京：高等教育出版社，１９９９．［７］童一中．生物统计法［Ｍ］．长沙：湖南科技出版社，１９８６．图１ＯＤ值测定酵母菌Ｙ１生长曲线［８］陈毓荃．生物化学实验方法和技术［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．Ｆｉｇ．１ＴｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｙｅａｓｔＹ１ｂｙＯＤ６００ＧｒｏｗｔｈＣｕｒｖｅｓｏｆＯｌｅａｇｉｎｏｕｓＹｅａｓｔｉｎＨｉｇｈＤｅｎｓｉｔｙＬｉｑｕｉｄＭｅｄｉｕｍＤｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙＭＡＹｏｎｇ，ＴＵＹａ，ＣＨＥＮＸｉｕ－ｌｉ，ＭＥＮＺｈｏｎｇ－ｈｕａ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢａｏｔｏｕＴｅａｃｈｅｒｓＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂａｏｔｏｕ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ０１４０３０）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｏｌｅａｇｉｎｏｕｓｙｅａｓｔＯＤ６００ｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｔｉｍｅｗｈｉｃｈｗａｓｉｎｔｈｅｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍｗａｓｄｉｌｕｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎｗｈｉｃｈｗａｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｔｉｍｅ．ＵｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｓｅｔｏｆｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎｏｆＯＤ６００，ｙｅａｓｔＹ１ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｗａｓｄｒａｗｎｕｓｉｎｇｔｈｅＯＤ６００ｖａｌｕｅｓａｆｔｅｒｔｈｅｒｅｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｃａｎａｃｃｕｒａｔｅｌｙｒｅｆｌｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｒ．ＢａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｙｅａｓｔＹ１ｏｃｃｕｒｒｅｄｆｏｕｒｓｔａｇｅｓｕｎｄｅｒｓｕｉｔａｂｌｅｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｌａｇｐｈａｓｅ，０～４ｈｏｕｒｓ；ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｐｈａｓｅ，４～２４ｈｏｕｒｓ；ｓｔａｔｉｏｎａｒｙｐｈａｓｅ：２４～６８ｈｏｕｒｓ；ｄｅｃｌｉｎｅｐｈａｓｅ：ａｆｔｅｒ６８ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈａｉｍｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｓｅａｒｃｈｓｏｌｕｔｉｏｎｓｔｏｓｉｍｉｌａｒｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎｄｅｔａｉｌａｎｄｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒｒｅｌａｔｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓｙｅａｓｔ；ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ；ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ；ｒｅｇｒｅｓｓｉｖｅｅｑｕａｔｉｏｎ１１８'