分光光度法测定蜂花粉中的总黄酮

'万方数据第28卷第2期2009年5月河南大学学报(医学版)JournalOfHenanUniversity(MedicalScience)V01．28No．2May．2009分光光度法测定蜂花粉中的总黄酮龚叶南(大连化工研究设计院，辽宁大连116023)摘要：_曲：从蜂花粉中提取总黄酮，并测定其含量。方陆：采用分光光度法，以芦丁为对照品制定标准曲线。水浴法的工艺条件为：以蜂花粉为原料，∞(EtOH)=80％为提取液，m(蜂花粉)：m(提取液)=l一25．水浴回流提取3h；在此条件下，砷(黄酮)=1．597％。超声法的工艺条件为：以蜂花粉为原料，妒(Et()H)=80％为提取液。研(蜂花粉)：m(提取液)=1：15，水浴回流提取60rain；在此条件下．伽(黄酮)=1．340％。结亲：平均加样回收率为100．5％，RSD=4．27％(n=5)。结论：水浴回流法具有较好的黄酮得率，但超声法具有节省时间的优势。关键词：蜂花粉；黄酮；分光光度法；提取工艺中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1672—7606(2009102--0121--04DeterminationonthecontentsoftotalflavonoidsfrombeepollenwithspectrophotometryGONGYe-nan(DalianResearchandDesignInstituteofChemicalIndustry，Dalian116023，China)Abstract：0bjective：Toextractanddeterminethecontentsofflavonoidsfrombeepollen．Methods：SpectrophotometrymethodwasdevelopedtOdeterminethecontentsoftotalflavonoids．andstandardcurvewasestablishedusingrutinasastandard．Bywaterbathingextraction，beepollenwasrefluxedwith25一foldextractant∞(EtOH)=80％]for3htOgiveflavonoidsinmassfractionof1．597％．Byultrasonicwaveextraction，beepollenwasextractedwith15-foldextractantb(EtOH)=80％]for60mintOgiveflavonoidsinmassfractionof1．340％．Results：Therecoveryratewas100．5％．RSD=4．27％(行=5)．Conclusion：Water·bathingextractionhadabetteryieldofflavonoids。whiletheultrasonicwaveextractioncouldsavemoretime．Keywords：Beepollen；Flavonoids；Spectrophotometry；Extractingtechnology蜂花粉(beepollen)为蜜蜂采集的雄蕊花的粉状物质，具有多种保健功能，能增强机体免疫力，防止动脉硬化、高血脂、高血压、静脉曲张等¨]，被誉为“完全营养食品”、“全能的营养食品”、“浓缩的天然药库”、“全能的营养库”、“内服的化妆品”、“浓缩的氨基酸”等，是“人类天然食品中的瑰宝”。蜂花粉的生物活性与其含有丰富的黄酮类成分密切相关。现代药理实验证实，蜂花粉中的黄酮类成分有软化毛细血管、增强毛细血管强度的功效，并且可提高血管壁的抵抗力。降低通透性，因而能够预防因毛细血管变脆而引起的各种出m症[2]。作者分别采用水浴回流技术和超声技术对蜂花粉中的总黄酮进行提取，并对其含量进行测定。1仪器与材料1．1仪器电子天平(上海天平仪器厂)；$22PC型分光光度仪(上海棱光技术有限公司)；HH—S2系列恒温水浴锅(江苏省金坛市环市科学仪器)；SK8200H台式超声清洗器(上海科学超声仪器有限公司)；DGG一9070B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪有限公司)等。1．2材料芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)；野玫瑰收稿日期：2009—02—21作者简介：龚叶南(1960一)，女，江苏无锡人，高级工程师．从事精细化工科研工作。 万方数据122河南大学学报(医学版)，2009年，第28卷第2期蜂花粉(广东省茂名养生源蜂产品人民北路专卖店)；无水乙醇(AR，天津市广成化学试剂有限公司)；亚硝酸钠(AR，上海化学试剂采购供应站)；硝酸铝(AR，广州化学试剂厂)；氢氧化钠(AR，天津市广成化学试剂有限公司)。2方法2．1测定方法的依据以芦丁为对照品测定蜂花粉中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH，使黄酮化合物与铝盐形成络合物在可见区获得稳定的特征吸收峰。2．2对照品溶液的制备与测定波长的选择精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg，用9(EtOH)=80％的乙醇溶解，定容到50ml，摇匀后即为对照品溶液(o．2mg／m1)。取对照品溶液3ml，置于25ml的容量瓶中，加硼(NaN0：)一5％的水溶液表1芦丁浓度的测定结果Table1Resultsofconcentrationofrutin1ml，放置5rain，加叫[Al(NO。)。]=10％的水溶液1ml，放置5min。加入叫(NaOH)一4％的水溶液4ml，加p(EtOH)一50％的乙醇溶液定容至刻度，摇匀。放置10min后，于分光光度计上在400～600nm内进行扫描最大吸收波长，结果在510nm处有最大吸收峰，故选定510nm作为测定波长。2．3方法学考察2．3．1标准曲线的绘制[3]精密吸取对照品溶液0ml、0．5ml、1．0ml、2．0ml、3．0ml、4．0ml于10ml容量瓶中，分别加入硼(NaNO：)一5％的水溶液0．5ml，放置5min。加硼[-Al(N03)3]=10％的水溶液0．5ml，放置5min。加入叫(NaOH)一4％的水溶液2ml，加p(EtOH)=50％的乙醇溶液定容至刻度，摇匀。放置10min，以∞(EtOH)=50％的乙醇溶液为空白作参比，于510nm处测其吸光度，结果见表1。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线(图见1)，得标准曲线方程：A一9．0968C一0．0004，r一0．9997。0O0"2O040∞O08仉1芦T标准曲线(nlg柚L)图1芦丁标准曲线Figure1Thestandardcurveofrutin2．3．2精密度实验精密称取蜂花粉约3g，加入50ml币(EtOH)=80％的乙醇溶液回流提取1h，准确吸取提取液1ml，置于10ml的容量瓶中，按标准曲线制备方法显色，以不加芦丁标准品的溶液作空白，测定其吸光度。连续测定5次，RSD=0．84％，说明仪器精密度较好。2．3．3稳定性实验精密吸取2．3．2所得提取液1ml，置于10ml的容量瓶中，按标准曲线制备方法显色，以不加芦丁标准品的溶液作空白，分别于5min、10rain、20rain、30rain、60min时测定其吸光度，RSD=1．84％，表明提取液在1h内较稳定。2．3．4加样回收率实验向已知含量的蜂花粉(质量浓度为1．282mg／ml，吸取1ml置于10mI的容量瓶，共5份)中加入不同量的芦丁对照品进行实验，平均回收率为100．5％，RSD一4．27％(1"1=5)，表明方法回收率较好。2．4正交实验设计[a-6]2．4．1水浴回流法在质量、提取工艺相同条件下。考察了乙醇浓度、料液比、回流时间等因素的影响，选用正交表L。(34)安排实验，见表2。2．4．2超声提取法在质量、提取工艺相同条件下。考察了乙醇浓度、料液比、超声时间等因素的影响。选用正交表L。(34)安排实验，见表3。3结果3．1蜂花粉中总黄酮的浓度r7-91准确称取蜂花粉1g于100ml的圆底烧瓶中，按2．4节进行正交实验，精密吸取提取液1ml于10¨"：；¨¨¨”¨o葺窄譬 万方数据龚叶南：分光光度法测定蜂花粉中的总黄酮123ml的容量瓶中，按照上述标准曲线制备方法显色，测度，结果见表4。定其吸光度，由标准曲线方程求出稀释液中总黄酮浓表2水浴回流因素水平表Table2Factorlevelofwater—bathingextraction裹3超声因素水平表Table3FactorIevelofultrasonicwaveextraction表4正交实验设计及结果表Table4Resultsoforthogonalexperimentaldesign1l177．572．821251．157．931337．O27．14212106．188．552357．556．4623149．635．0731390．882．5832154．651．393244．331．5I165．6274．4181．7水浴回流法：Ⅱi213．2163．2185．3＆=568．5Ⅲ．189．7130．9201．5P=35910．3R：47．6143．519．8QI36287．939688．135984．4S377．73777．974．2Ii157．8243．8159．I超声法：Ⅱi179．9165．6177．9Ec一503．0Ⅲi165．393．6166．0P一28112．1R．22．1150．218．8Qi28196．331874．328172．4S84．23762．260．3注：样品均为吸取1．0ml提取液，Q．=(I，2+II．2+Ⅲ。3)／3。P；(Xc)2／9．S．=QI—P3．2方差分析为了确定显著性因子，对表4进行方差分析和显著性检验，结果见表5。3．3最佳条件的选择3．3．1水浴最佳条件从表4的直观分析和表5的方差分析可知，3种因素对提取结果影响大小依次为B>A>C。从表4可知，其最佳组合为A：B。C。，即最佳提取条件为用15倍原料重的午(EtOH)=80％的乙醇水浴回流提取3h。在此条件下，按照上述标准曲线制备方法显色，测得其吸光度为0．968，由标准 万方数据河南大学学报(医学版)，2009年，第28卷第2期吸收曲线计算出总黄酮质量分数为1．597％。寰5方差分析和显著性检验··Table5Analysisofvarianceandtestofsignificance注IF(2，2)o．oJ=99IF(2，2)o．05=19IF(2。2)o．I=9；F(2．2)o．z=4；F(2，2)o25=33．3．2超声最佳条件显著性检验结果表明，3种因素对浸提结果影响大小依次为B>A>C，从表4可知最佳的组合为A：B，Cz，即最佳条件为用15倍原料重的cp(Et()H)=80％的乙醇超声60min。在此条件下，按照上述标准曲线制备方法显色，测得其吸光度为0．812，由标准吸收曲线计算出总黄酮质量分数为1．340％。4讨论本次实验采用了水浴回流和超声技术两种方法提取蜂花粉中的总黄酮含量，其工艺简单、操作步骤少、无污染，很容易实现绿色工艺生产。结果表明，水浴回流的最佳提取条件为：用15倍原料重的‘p(EtOH)=80％的乙醇水浴回流提取3h；在此条件下，黄酮质量分数可达1．597％。超声提取法的最佳条件为：用15倍原料重的中(EtOH)=80％的乙醇超声60min；在此条件下。黄酮质量分数可达1-340％。在水浴回流与超声方法两种方法的比较中，影响蜂花粉中总黄酮提取的主要条件相同，所不同的是水浴回流提取时间较超声提取时间要长。由上述数据可以看出，水浴回流法具有较好的黄酮得率，但超声具有节省时间的优势。近年来大量的药理研究表明。黄酮具有抗血栓、抗衰老、抗动脉硬化、抗心律失常和抑制HIV等作用[1⋯，蜂花粉是传统的营养保健食品，资源丰富，开发后不会对环境造成任何破坏影响，通过提取其中的总黄酮作为食品抗氧化剂，应具有较大的开发应用价值，本实验为蜂花粉的进一步开发和合理利用提供了基础资料。参考文献：[1]刘风云．张坚，许子俊，等．青海油菜蜂花粉营养成分分析测定EJ]．蜜蜂杂志，1994，14(10)：3—6．[2]刘强．蜂蜜的保健功能与药用便方[M]．北京：金盾出版社，1999：51．F33梁惠花，刘晓河，王志宝，等．坝上油菜蜂花粉中总黄酮的超声提取及含量测定[J]．2003，20(4)：8—9．F4]肖建波，邹登峰，朱华。等．正交设计提取梨皮总黄酮[J]．中国林副特产，2004，19(6)：9—10．[5]魏永生，郑敏燕，王永宁．等．青海油菜蜂花粉黄酮类化合物含量的研究[J]．西北植物学报，2004。24(2)：301—305．[6]唐津忠，鲁晓翔，陈瑞芳．金莲花中黄酮类化合物的提取及其抗氧化性研究[J]．食品科学，2003．24(6)：88—9l-[7]罗伟强，黄润均．邓光辉，等．苦买菜茎黄酮类化合物提取方法研究[J]．广西民族学院学报，2003，9(1)：31—32．[8]黄阿根。钱建亚，谭道经，等．荷叶黄酮提取工艺研究[J]．食品与机械，2000．14(5)：14—15．[9]李维莉，马银海。彭永芳，等．蜂胶总黄酮提取方法研究[J]．食品科学，2003．24(1)：100—101．[103毛丽珍，徐世芳．蜂胶口服液中黄酮类化合物的测定[J]．中草药，1998，29(4)：231—232．[责任编辑段金卯]'