紫外分光光度法在退变腰椎间盘髓核胶原蛋白水平测定中的应用

'维普资讯http://www.cqvip.com山东医药2007年第47卷第29期紫外分光光度法在退变腰椎间盘髓核胶原蛋白水平测定中的应用楚万忠，李晓光，刘佰川，张凯宁，吴莹光(1泰山医学院，山东泰安271016；2山东省千佛山医院)[摘要]用手术中摘除的退变髓核为样本，采用紫外分光光度法(测定波长为560nm)测定退变腰椎问盘髓核胶原蛋白的含量。结果吸光度(Y)与L(一)一羟脯氨酸浓度(X)呈良好线性关系，线性回归方程为Y=0．2375x+0．0015(r=0．9999)，平均回收率为99．75％，胶原蛋白占髓核干重平均为38．35％。证明紫外分光光度法是一种测定退变腰椎问盘髓核胶原蛋白含量的简单快速可靠的方法[关键词]退变髓核；胶原蛋白；紫外分光光度法；含量[中图分类号]R681．5[文献标识码]B[文章编号]1002-266X(2007)29-0035-02腰椎退行性变是临床上的常见病和多发病，胶用蒸馏水稀释定容(临用前配)，浓度为10g／ml。原蛋白是细胞外基质的主要成分，含有大量的甘氨2方法酸、羟脯氨酸等，其中羟脯氨酸(Hyp)为胶原蛋白所髓核中的胶原蛋白在6mol／L盐酸溶液中120特有，且含量较稳定。2006年8月～2007年1月，℃水解后，可释放出Hyp，Hyp与氯氨T氧化脱羧生我们采用紫外分光光度法测定退变腰椎间盘髓核胶成吡咯。吡咯与PDAB反应生成棕红色化合物，用原蛋白水平，现报告如下。紫外分光光度计在波长560nm处进行比色测定。1材料测定Hyp的含量后乘以固定相应系数即得胶原蛋白1．1实验材料标本为36例腰椎间盘突出症患者含量。手术摘除的髓核组织(术前腰椎MRI检查证实有明2．1胶原蛋白含量测定采用Hyp法¨J。显退变)。于放大镜下仔细剔除软骨终板和周围韧2．1．1L(一)一Hyp标准曲线的绘制准确吸取带，用生理盐水漂洗除去血迹，置一196℃液氮中Hyp标准工作液10、20、30、40、50m1分别置于不同保存；试剂为丙酮、无水乙醚、无水乙醇、氯胺T、氢氧的100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，Hyp浓化钠、盐酸、三氯醋酸、浓硫酸、枸橼酸钠、醋酸钠、高度分别为1、2、3、4、5g／ml。准确吸取上述稀释好氯酸、对二甲氨基苯甲醛(PDAB)、L(一)一Hyp(Sig的溶液4ml置于20ml具塞试管中，加入氯胺T2ma公司)，均为分析纯。恒温水浴锅，UV755B型紫ml，摇匀，加入3．15mol／L的高氯酸1ml，20min后外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，电热加人5．0％PDAB2ml，60℃水浴20min，冷却30恒温鼓风干燥箱，电子天平，电热恒温培养箱，离心min后，在波长560nm处预0定吸光度(OD)值，绘制机。标准曲线。以蒸馏水为空白对照。1．2主要试剂及配制①缓冲液：枸橼酸钠50g，2．1．2测定步骤①髓核脱脂：将髓核碎片用丙醋酸12ml，醋酸钠120g，氢氧化钠34g，加水至酮、乙醚脱水脱脂过夜，然后置50℃烘箱中干燥41000ml，pH为6．0，冷藏保存；②氯胺T试剂：1．4gh；②提取胶原：称取干燥后的髓核组织50mg，加入氯胺T溶解于100ml上述缓冲试剂中(现配现用)；三氯醋酸后，置90℃恒温箱3h，冷却后在3500r／③5％对二甲氨基苯甲醛：5gPDAB用少量甲醇溶min离心5min，留上清液，沉淀依上法再提取一次，解并定容至100ml；④Hyp标准储备液(1000g／合并两次上清液置于100℃烘箱中蒸干；③制备待m1)：准确称取100mgHyp标准品，置于100ml容量测样品：加2ml、6mol／LHC1溶解全部干燥样品，放瓶中，加蒸馏水溶解；加l滴3．0mol／L硫酸，定容至于120℃烘箱中水解10h，取水解液20l，加入蒸100ml。4℃下保存(不应超过1个月)；⑤Hyp标准馏水6000l，配成待预4样品；④测定Hyp：取待测样工作液：吸取5ml上述储备液于500ml容量瓶中，品4ml，按照“1．6②”测定。样品测得浓度：标准品 维普资讯http://www.cqvip.com山东医药2007年第47卷第29期浓度×所测样品OD值／标准品此浓度OD值，胶原表3Hyp回收率百分含量(mg／g)=(样品Hyp浓度×稀释倍数)×D×100／组织量(D为计算常量=7．46)2．2Hyp回收率测定准确称取20mg和40mg标准Hyp，配制成4．0g／ml溶液，测定560nln处OD值，按线性回归方程计算浓度，并计算回收率。3结果4讨论3．1Hyp标准样品浓度与OD值见表1。腰椎问盘髓核是人体最早且最易发生退行性变表1Hyp标准样品浓度与OD值的组织，退变时髓核细胞中出现合体细胞和巨大细样本号H啡液OD值胞；细胞由软骨细胞变为成纤维细胞；细胞基质颗粒m1)(A)O．OO．OO．O样皱缩，严重退变时髓核完全纤维化，与纤维环成一10．01．00．238整体3j。同时髓核内蛋白酶引起蛋白多糖降解‘4J，20．02．00．478胶原组织代偿性增生；蛋白多糖和水分减少，胶原含30．03．OO．71740．04．0O．951量相对增多。Hyp是反映胶原含量的稳定指标，其50．05．O1．187水平变化可反映退变腰椎间盘髓核中胶原蛋白含以Hyp浓度(C)为横坐标，OD值(A)为纵坐标量。绘制标准曲线，可见在1～5ml浓度范围内二紫外分光光度法是依据物质分子对紫外区辐射者有良好的线性关系，线性回归方程为：y=0．2375x能的选择性吸收特性进行成分分析的方法。由于大+0．0015(R=0．9999)，标准曲线见图1。部分有机物在紫外区产生吸收峰，所以该法是有机物分析测定的首选方法。该法不需对样品进行分1．2离、掩蔽或转化即可测定其中成分的含量，为难分离1．0样品的含量测定提供了方便。本文结果显示，采用0．8该法测定髓核中Hyp的含量有较好的回收率(平均OD值0．699．75％)，退变腰椎间盘髓核中胶原蛋白含量及质量浓度比平均为383．47mg／g，占髓核干重的0．438．35％，高于胡有谷报道‘5(正常占J5％～20％干0．2重)。O综上所述，紫外分光光度法是一种测定退变腰0123456浓度C椎间盘髓核胶原蛋白含量简单快速可靠的方法。图1Hyp标准曲线[参考文献]3．2髓核Hyp浓度及胶原蛋白含量髓核中胶原[1]包晓群，杨晓钰，朱庆三．胶原及蛋白多糖含量测定在诊断颈椎问盘突出症中的应用[J]．白求恩医科大学学报，1999，25(3)：蛋白占髓核干重平均为38．35％，Hyp浓度和胶原蛋276-277白含量见表2。[2]汪家政，范明．蛋白质技术手册[M]．北京：科学出版社，2001：表2髓核中Hyp浓度及胶原蛋白含量47．[3]彭宝淦，施杞．退变椎间盘的组织病理学变化[J]．中国中医骨伤科，1996，4(6)：52-54．[4]KangJD，Stefanovic—RacicM，MclntyreLA，eta1．Towardabio—chemicalunderstandingofhumanintervertebraldiscdegenerationandherniation[J]．Spine，1997，22(1O)：1065—1073．[5]胡有谷，吕振华，陈晓亮．腰椎间盘的细胞、胶原和弹性蛋白[J]．中华骨科杂志，1997，17(1)：8-9．(收稿日期：2007-06．17)3．3样品回收率见表3。平均回收率为99．75％。36'