薄层色谱紫外分光光度法定量测定微生物发酵产物辅酶q10

'应用与环境生物学报!"##$，!"（%）：&"#’&"%!!!"#$%&’’()$*#+,$-#,((.//0122343567!"##$)#$)"*!薄层色谱紫外分光光度法定量测定微生物发酵产物辅酶+,#,，",,,!郜晓峰!范成英!何开泽!官家发,"（中国科学院成都生物研究所!成都!$,##&,；中国科学院研究生院!北京!,###&-）摘!要!报道了一种微生物发酵液中辅酶+,#的定量检测方法.该方法分为两个步骤：第一步是离心收集菌体和结合使用超声波处理的辅酶+,#丙酮抽提；第二步是硅胶薄层色谱，根据标样位置取产物斑点乙醇洗脱后用紫外分光光度法测定辅酶+,#含量.结果表明，该方法具有操作简便、重复性好、相对误差小等优点，可用于细菌发酵生产辅酶+,#研究过程中发酵产物的快速定量检测.图"表"参$关键词!辅酶+,#；薄层色谱；紫外定量分析#$#!+-%-.-/"0+&$&.1"2$*/%&’()*)’)*+,-(’./0*012#1,(3/4,5%,#26147*8619*’.#&.)&6,9/:$#5;<=>,8)61>?1)14,)6/,，",,,!34256789:;<，=4>?@:;H6797,（!"#$%&’($)*+*’*#,-.+,/,%0，!"+$#)#123(,-52+#$2#)，?@:;7?P*<，蒸馏水酶+,#的研究和生产.,###SY，WB/."’/.*.发酵培养基：葡萄糖,#<，蔗糖"#<，玉米浆,#<，（>B&）"d2&*<，e）和辅酶30#标准品（?）紫外扫描吸收曲线图9*4102>@A<(@B+CDE(FB<:AG$H;B（>）G+ID可知，在"75#!4)$%区间内，吸按照01615标准曲线建立方法，辅酶3标准溶液经硅胶0#光度和辅酶30#浓度的线形关系较好，并以#O$P%&（&为辅板展层、挖取点迹，加入砂芯漏斗中，无水乙醇洗脱，洗脱液定酶30#浓度，单位!4)$%；#为光吸收值）方式进行回归分析，溶至/$%，此时质量浓度梯度应为"、0#、0"、!#、!"、5#!4)$%，得到回归方程#O#1#-"&Q#1##,5，相关系数’O#1,,,1当辅以无水乙醇点迹洗脱液作空白对照，测定!6"+$下的吸光度酶30#浓度大于5#!4)$%时，与吸光度不成线性关系1!1以洗脱液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线， +11;;;;;;;;应用与环境生物学报;;!"#$%&’’()$*#+,$-#,(;;;;;;;;;;;;;;;;;$1卷或以!!""#$（$为辅酶#$%浓度，单位!&’()；!为光吸收中，无水乙醇洗脱，洗脱液定溶至+()，测定1/28(下的吸光值）方式进行回归分析，得到辅酶#$%标准紫外吸收曲线，回归度!（’）*根据标准曲线或回归方程!!%*%$++$,%*%$-$计方程为!!%*%$++$,%*%$-$，相关系数%!%*../，数据回归处算洗脱液中辅酶#$%浓度*样品中辅酶#$%含量为理结果指出，在$%0-%!&’()区间内辅酶#$%浓度和吸光度+$:$%%%’2%(!的线形关系较好，中心浓度吸光度是%*1/2，如图134所示*1取2%!)待测样品点样于5612+硅胶板，风干后用苯做展其中，(为每克湿细胞中辅酶#$%含量（!&），$为标准曲层剂，展层时间$%(78*硅胶板阴干后，在紫外分光仪下确定展线上与样品光吸收度!相应的辅酶#$%浓度，$%%%表示$%%%层后的点迹，刮下与标准品同样&9值的斑点，加入砂芯漏斗!)，2%表示点样量2%!)，1表示湿菌体1&*图1;辅酶#$%紫外吸收曲线（<）和吸收标准曲线（4）67&*1;=>?@ABC@D8EFGCHD（<）?8I=>?@ABC@D8EAE?8I?CIFGCHD（4）B9JB#$%1*+;重现性实验筛选、菌种的改良、发酵条件的优化以及产物的分离纯化等*这按照$*.重现性实验方法考查了本测定方法的重现性，结些研究过程中具有大量发酵样品，需要进行辅酶#$%的定量分果见表$，可以看出，本测定方法具有较高重现性*析测定*辅酶#$%是一种脂溶性胞内产物，需先将其提取出来［2］再进行定量测定，细胞中辅酶#$%的提取方法早有报道，然表$;放射形土壤杆菌中辅酶#$%含量的重现性实验而常见的皂化法、溶剂萃取法、吸附层析法等都存在提取费时K?@LD$;MDNCBIGF7@7L7EOEDAEB8FB8ED8EB9JB#$%78’)%"*+,#"-./%费事等缺点，不适用于微生物发酵法生产辅酶#$%研究中大样样品号0（JB#）’(&0’(&MPR’S本量的细胞中辅酶#$%的提取*本方法采用丙酮超声法提取细$%P?(NLDQB*菌中的辅酶#$%，具有成本低、快速、简便易行的优点*$%*T$微生物细胞中的辅酶#$%提取出来后，YZ)J法可用于辅1%*2U［T］-%*2U%*2.1*U$酶#$%的精确定量测定，但是对样品品质要求较高，分析费+%*2/时，不能满足大量样品的快速定量测定要求*在辅酶#$%定量2%*T$测定中，虽然薄层色谱扫描仪可对付大样本量，但其价格昂贵，定量分析时线性关系很差*本方法采用薄层色谱紫外分光光度1*2;加样回收率法，对细菌中的辅酶#$%进行定量分析，具有操作简便、样品处按照$*$%加样回收率测定方法进行加样回收率实验，结理简单、适用于大样本量辅酶#$%定量分析的优点*本方法在果见表1，可以看出，丙酮超声提取细菌细胞辅酶#$%方法具有$%0-%!&’()辅酶#$%浓度范围内具有较好的线性关系，结较好的回收率：平均回收率为$%$*$+S，MPR为$*+TS（1!果可靠，相对误差较小，重现性好*2）*根据本方法的预试验结果，重复-次丙酮超声处理后，可表1;辅酶#$%的加样回收率认为细胞中辅酶#$%抽提完全，更多次数的丙酮超声处理并没K?@LD1;MDFBHDCOC?EDB9JB#$%?9EDC?II78&A?(NLD有增加辅酶#$%测出量*菌体中辅酶加入辅酶#$%的质量测定值回收率根据本方法多次预试验结果，按照常规分析化学技术，采#$%含量VD7&WEB9?II78&XD?AGCDIMDFBHDCO用脱脂棉过滤洗脱硅胶粉中的辅酶#$%时，由于脱脂棉的多少JB#$%FB8ED8EJB#$%H?LGDC?ED（0’(&）（0’(&）（0’(&）（%’S）和松紧不同会造成严重定量测定误差，所以应采用与硅胶粒度%*2.%*2$*$%$%1相符孔径的小型砂芯漏斗过滤洗脱硅胶粉中的辅酶#$%*%*2.$*%$*2U..此外还值得一提的是，作者在预实验中发现，辅酶#$%标%*2.$*21*$-$%1*/准溶液在室内环境下放置+UW后1/28(下的吸光度显著降%*2.1*%1*T%$%%*2低，而暗室中吸光度变化不大*为了降低实验误差，在样品制备%*2.1*2-*$-$%$*T与测定过程中，尽量减少光照时间和强度是极其重要的*作者在进行微生物法生产辅酶#$%的长期研究过程中体-;讨论会到，建立新的、适合大样本量的辅酶#$%定性定量检测法是微生物发酵法生产辅酶#$%的研究涉及辅酶#$%产生菌的进行菌种筛选、菌种改良、发酵条件优化以及产物分离纯化等 %;期郜晓峰等：薄层色谱紫外分光光度法定量测定微生物发酵产物辅酶"#$=%>;%一系列研究工作的基础!辅酶"#$定性定量检测是本项目的瓶"!)).，>$$=，,--)（#<>）：#S#<#99颈所在，本文报道的方法同当今用于生物活性物质筛选的高通=%F6PT（顾觉奋），U4)8FN（陈光明），E2DV（李淑珍）!12’308+4)L量筛选方法相比较，仍然相距甚远、不尽完善，希望能有更简便323’5U’"#$(0H2K*’’*W/823H+*/835’*H/+2’8!/(’*(/,$(%01"（药学进的适用于微生物发酵法生产辅酶"#$研究的产物定量分析方展），>$$#，*.（X）：;;9<;=;法出现!Y%-60/8WZC（欧阳平凯），.6[.（胡永红）!Z*’A6K+2’8/8A/JJI2K/L!"#"$"%&"’+2’8’5K’)8M0H)L"#$!+,-%23453*/(’*(（化工进展），#99=，(：9<###%&’()*+,-，./**0&!12’30+4)323’56(27628’8)!!"#$%&’(%，#9:;，X%&6+4@.，N/*OP@，&2K4/*A@!D’I2ALJ4/W))]+*/K+2’8’5I2J2A5*’H()：#<=;0$11,$(’%61-71-(-8"7"$-5’II’^)A(042W4LJ)*5’*H/8K)I2762AK4*’H/+’WL>%./83?，@8A*)0BC，C/+*28D，E/*3F!G4)H6I+2JI)568K+2’83’5K’)8L*/J40/8/I0323’5K’)8M0H)L"K’8+)8+!.3$9)"’1,-%，>$$#，*+-：#=#M0H)"!)"’’(*+,-%，>$$#，*+：#<#;<#=;;%N2O/)IG，P)*O)*-，F63+/QR!N)/+/(’I23H/8A568K+2’8’5K’)8M0H)'