分光光度法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量_张文莉

'第29卷第5期中华中医药学刊Vol．28No．52011年5月CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEMay2011中分光光度法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量药研12，32张文莉，高敏，石森林究(1．宁波大学医学院附属医院药剂科，浙江宁波315020;2．浙江中医药大学药学院，浙江杭州310053;3．上海睿智化学研究有限公司，上海201203)扫描摘要:目的:建立山楂叶提取物中总黄酮的含量测定方法。方法:以芦丁为对照，采用两种紫外－可见分光光度法对不同条件处理下的山楂叶提取物中总黄酮含量进行测定和比较分析。结果:山楂叶提取物中总黄酮的含量以硝酸铝显色法(510nm)测定为86．15%;氯化铝显色法(272nm)测定为35．19%。结论:两种紫外－可见分光光度法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量有较大差异，采用何种方法测定其总黄酮的含量还有待进一步考究。关键词:山楂叶提取物;总黄酮;紫外－可见分光光度法中图分类号:R284．1文献标识码:A文章编号:1673－7717(2011)05－1148－04DeterminationofFlavonoidsofHawthornLeavesExtractbySpectrophotometry12，32ZHANGWen-li，GAOMin，SHISen-lin(1．DrugFamilyinHospitalofNingboUniversity，Ningbo315020，Zhejiang，China;口这种作用主要是由于VEGF对血管内皮细胞的生长刺激活血化瘀是缺血性中风十分有效而常规的治疗方法。治疗［3］性血管新生能有效地恢复脑组织血供，促进神经发生、神经作用和趋化作用。新血管的形成来源于先前存在的血管的内皮细胞增殖，而内皮细胞增殖有赖于VEGF的刺激。营养、神经保护和抗凋亡。因此活血化瘀的促血管新生疗VEGF对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷法逐渐被引起重视。活血可祛瘀，瘀血去则新血生，称之脂酶短暂地诱导Ca释放而发生的，VEGF为分泌性蛋白，“祛瘀生新”。“生新”不仅是传统意义上的生新血，而且还作用于特异性受体，它与受体结合使血管通透性增高，导致包含有“生新络”的含义，瘀血去，则新血及新络生，生新又［4］反过来促进瘀血的祛除。复方丹参片是由丹参、三七、冰片血浆中大分子物外渗。可为组织修复提供养分，多种其他促血管生成因子，如:bFGF，PDGF，TNF等能通过直接或等组成，具有活血化瘀、理气止痛等功效，本实验证明复方间接影响VEGF和/或其受体信号传导起作用，从而保护脑丹参片可提高急性脑缺血大鼠神经功能缺损评分，改善缺毛细血管内皮细胞．防止毛细血管消失，同时刺激内皮细胞血组织的病理形态，缩小脑梗死面积，初步考虑与复方丹参增殖、血管新生、神经功能迅速恢复。bFGF是一种广谱的片能提高缺血脑组织中VEGF、bFGF蛋白表达，及时促进有丝分裂原，具有广泛的细胞增殖效应，它对广泛的来源于新生血管形成，重建侧枝循环挽救缺血半暗带有密切关系。中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用，其靶但其具体作用机制及其环节，还需进一步研究证实。细胞有成纤维细胞、血管内皮细胞、神经元和胶质细胞参考文献［5］［1］曾昭枝．复方丹参片伍用阿司匹林治疗中老年人心肌缺血的等。它可直接作用于内皮细胞刺激血管新生(包括迁临床观察［J］．中国当代医药，2010，6(6):80．移、增生、出芽和管腔形成等多个环节)，也可上调VEGFm-［2］LongaEZ，WeinsteinPR，CarlsonS，eta1．Reversiblemiddlecer-RNA的表达而发挥间接的调节作用。人们已经认识到bF-ebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats［J］．Stroke，［6］GF改善微循环、促进中枢和外周神经发育、生长等作用，1989，20(1):84－91．利用外源性bFGF来治疗脑梗死，但是临床试验通过静脉［3］MartiHJ，BernaudinM，Bel1ailA，eta1，Hypoxiainducedvascular给予生长因子如bFGF未观察到明神经保护作用。目前，endothelia1greowthfactorexpressionprecedesneovascularization内源性VEGF和bFGF对于治疗缺血性脑损伤至关重要。aftercerebra1ischemiam［J］．Patho1，2000，156:965－976．中中医学认为缺血性中风是因各种致病因素作用下发生［4］SengerDR，BrownLF，ClafeyKP，eta1．Vascularpermeability华的“脑络瘀阻”，其病理因素有“风、火(热)、痰(饮)、瘀、factor，tumorangiogensisandstromageneration［J］．InvasionMe-中医毒”五种，病理关键是“瘀血”。大量基础和临床研究证实，tastasis，1994－1995，14(1－6):385．药［5］冯英，王会军，等．β－巯基乙醇和bFGF分别诱导大鼠骨髓基质干细胞成神经元样细胞的生物学性状［J］．中山大学学11481148收稿日期:2010－12－17报，2010，1(1):28－32．学作者简介:张文莉(1971－)，女，浙江宁波人，主管中药师，研究方［6］TanakaR，MiyasakaY，YadaK，eta1．Basicfibreblastgrowth刊向:中药研究。factorincreasesregionalcerebralbloodflowandreducesinfarct通讯作者:石森林(1971－)，男，浙江浦江人，教授，硕士研究生导sizeafterexperimentalischemiainaratmodel［J］．Stroke，1995，师，博士，研究方向:药物制剂新剂型、新技术。26(11):2154－2158． 第29卷第5期中华中医药学刊Vol．28No．52011年5月CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEMay20112．CollegeofPharmacy，ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053，Zhejiang，China;3．ShanghaiChempartnerCo．，Ltd，Shanghai201203，China)Abstract:Objective:Tostudytheassaymethodoftflavonoidsinhawthornleavesextract．Methods:Selectingrutinascontrolarticle，thecontentsoftheflavonoidsinhawthornleavesextractthatdisposedthroughdifferentconditionsweremeasuredandcomparedandanalyzedbyusingtheultraviolet－visiblespectrophotometrywithtwomethods．Results:theconcentrationoftheflavonoidswas86．15%byusngtheAl(NO3)3(510nm)，andAlCl3(272nm)was35．19%．Conclusion:Theconcentrationofflavonoidsofhawthornleavesextracthadquitedifferentbyusingtheultraviolet－visiblespectrophotometrywithtwomethods．Keywords:hawthornleavesextract;flavonoids;UV－Vis［1］山楂中含有多种黄酮类化合物，近年来的许多研究液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至证明，山楂对心血管系统有降压、增加冠脉血流量、改善心刻度，密塞，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，分别在肌供血供氧等功效，对高血压、高血脂、冠心病、心绞痛等症200～800nm波长范围内扫描，见图1、2。根据结果，选用均有较好的疗效，是防治心血管疾病较好的天然植物资源，510nm为检测波长。其重要有效成分———山楂总黄酮，商品名山楂叶提取物，据分析主要为牡荆素鼠李糖苷(vitexinrhamnoside)、单乙酰牡荆碱鼠李糖苷(monoacetylvitexinrhamnoside)、金丝桃苷［2］(hyperside)及山楂酸(crataegicacid)等。有研究报道，以芦丁为对照品，以NaNO2－AI(NO3)3－NaOH为显色剂，于500nm附近测定山楂总黄酮含量，［3］方法专属性不强，有局限性，准确性较差;因此，本文采用NaNO2－AI(NO3)3－NaOH和A1C13两种常用的比色法，以芦丁为对照，用分光光度法法测定山楂叶提取物中总黄酮的含量，探讨其优缺点。1材料与仪器1．1试药芦丁对照品(中国药品生物制品检验所，批号100080－200707);山楂叶提取物(山东临沂爱康药业有限公司，图1芦丁吸收光谱图批号AKH081201);亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化铝、乙醇、甲醇等试剂均为分析纯;水为蒸馏水。1．2仪器UV－2450紫外分光光度计(日本岛津公司);KH－250DB型数控超声波清洗器(昆山禾创市超声仪器有限公司);JA2003N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);XS105分析天平(梅特勒－托利多仪器上海有限公司);DKS－24型电热恒温水浴锅(上海经济区沈荡中新电器厂);DGG－9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信试验仪器有限公司)。2方法与结果2．1NaNO2－AI(NO3)3－NaOH显色体系2．1．1对照品溶液的配制取芦丁对照品约25mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并稀释至刻度，中华密塞，摇匀，即得对照品溶液。图2山楂叶提取物吸收光谱图中2．1．2供试品溶液的配制取山楂叶提取物约50mg，精2．1．4标准曲线的制备精密量取对照品溶液各1、2、3、医药密称定，置50mL容量瓶中，加入50%乙醇适量超声处理4、5、6mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亚114915min后，取出，放凉，用50%乙醇稀释至刻度，密塞，摇匀，硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1149滤过，取续滤液作为供试品溶液。1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻学2．1．3检测波长的选择精密量取对照品溶液3mL和供度，密塞，摇匀，放置15min，以相应的试剂为空白，在510nm刊试品溶液1mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6mL，加处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶标，绘制标准曲线，结果得回归方程:A=0．0124C－ 第29卷第5期中华中医药学刊Vol．28No．52011年5月CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEMay20110.0153，r=0．9997，表明芦丁在10．052～60．312μg/mL浓称定，置25mL容量瓶中，加入乙醇适量超声处理30min，度范围内与吸光度呈良好线性关系。取出，放凉，用乙醇定容至刻度，密塞，摇匀，滤过，取续滤2．1．5精密度试验精密量取对照品溶液3mL，置25mL液，备用;精密量取上述山楂叶提取物溶液1mL和磷脂复容量瓶中，照标准曲线制备项下方法，自“加水至6mL”起，合物溶液3mL，分别置于25mL容量瓶中，用乙醇稀释至依法测定吸光度，连续测定6次，计算RSD值，结果RSD值刻度，密塞，摇匀，作为供试品溶液。为0．46%，表明仪器精密度良好。2．2．3检测波长的选择精密量取对照品溶液和供试品2．1．6稳定性试验精密量取供试品溶液1mL，分别置溶液各2mL，分别置10mL容量瓶中，分别加入1%的氯化25mL容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至铝溶液4mL摇匀，再加水至刻度，密塞，摇匀;以水加相应6mL”起，依法加入相应试剂，当显色体系反应完全后，每间显色剂为空白，于200～800nm波长范围内扫描，结果见图隔15min记录一次吸光度值，连续120min，计算RSD值，考3、4。根据结果:选择272nm作为检测波长。察其稳定性。结果:RSD值为1．90%，表明供试品溶液在显色后120min内稳定性较好。2．1．7重复性试验取山楂叶提取物约50mg，共6份，精密称定，分置50mL容量瓶中，加入50%乙醇适量，超声处理15min，取出，放凉，用50%乙醇稀释至刻度，密塞，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液各1mL，分别置25mL容量瓶中，照标准曲线制备项下方法，自“加水至6mL”起依法测定吸光度，计算山楂叶提取物总黄酮的含量。结果:山楂叶提取物中总黄酮平均含量为86.16%，RSD为1．00%，表明方法重复性好。2．1．8加样回收率试验在已知总黄酮含量的山楂叶提取物中加入一定量芦丁对照品，按供试品配制项下的方法制备成供试品溶液;精密量取供试品溶液各1mL，分置25mL容量瓶中，照标准曲线制备项下方法，自“加水至图3芦丁吸收光谱图6mL”起，依法测定吸光度。结果:9个样品的回收率在95.19%～103．81%范围内，平均回收率为99．30%，RSD值为2．80%，结果见表1。表明该方法测定的结果准确可靠。表1加样回收率试验结果称样量加入量实测值回收率平均回收率编号(mg)(mg)(mg)(%)(%)15．023．857．8598．9898．8225．143．948．11101．1635．073．827．7796．3145．034．718．6899．58100．1255．194．848．8296．9865．134．779．00103．8175．085．469．4299．8998．9585．165．519．3095．1995．055．549．56101．79图4山楂叶提取物吸收光谱图2．1．9样品测定取同一批山楂叶提取物约50mg，3份，2．2．4显色条件的优化(1)显色剂用量的考察:精密量精密称定，置50mL容量瓶中，加入50%乙醇适量，超声处理取对照品溶液各2mL，分别置10mL容量瓶中，分别加入15min，取出放凉，用50%乙醇稀释至刻度，密塞，摇匀，滤过，1%的氯化铝溶液各1、2、3、4、5mL摇匀，再加水至刻度，密取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液各1mL，分塞，摇匀;以水加相应显色剂为空白，于272nm处测定吸光中别置25mL容量瓶中，照2．1．4项下方法，自“加水至6mL”度，结果见表2。根据结果:显色剂的用量选择4mL。华中起，于510nm处测定吸光度，采用标准曲线法测定样品的含表2显色剂用量的的选择(n=2)医量，结果山楂叶提取物中总黄酮平均含量为86．15%。药显色剂用量/mL吸光度A1吸光度A22．2A1C13显色体系115011502．2．1对照品溶液的制备取芦丁对照品25mg，精密称10．4490．44620．4560．456学定，置100mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，密塞，摇刊30．4600．459匀，备用;精密量取上述对照品溶液10mL，置50mL的量瓶40．4650．466中，用乙醇稀释至刻度，密塞，摇匀，即得对照品储备液。50．4660．4662．2．2供试品溶液的制备取山楂叶提取物0．1g，精密 第29卷第5期中华中医药学刊Vol．28No．52011年5月CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEMay2011(2)显色后放置时间的考察:精密量取山楂叶提取物表4加样回收率试验结果供试品溶液2mL，置10mL量瓶中，加入1%氯化铝溶液4称样量加入量实测值回收率平均回收率编号RSDmL，摇匀，再加水至刻度，密塞，摇匀;分别放置0、5、10、20(mg)(mg)(mg)(%)(%)min后，以水加相应显色剂为空白，于272nm处测定吸光120．326．6113．30100．7299．711．29度，结果见表3。表明显色时间对总黄酮的测定无显著影220．896．7213．5599．90320．956．4913．5699．94响。419．976．8113．1497．21表3显色剂用量的的选择(n=2)520．346．5613．2099．81山楂叶提取物620．526．4713．23100．67显色时间/minA1A22．2．10样品测定取同一批山楂叶提取物3份，按2．2．00．4730．4732项下方法制备成供试品溶液;分别精密量取各供试品溶液2mL，分别置10mL容量瓶中，加入1%的氯化铝溶液450．4780．478mL摇匀，再加水至刻度，摇匀;于272nm处测定吸光度，采100．4780．478用标准曲线法测定样品的含量，结果山楂叶提取物中总黄200．4790．475酮平均含量为35．19%。RSD0．57%0．51%3讨论2．2．5标准曲线的制备精密量取上述芦丁对照品溶芦丁与NaNO2、AI(NO3)3、NaOH试剂反应产生红色物液各1、2、3、4、5、6mL，分置10mL容量瓶中，分别加入［4］质，文献认为其反应原理是发生在芦丁B环的3’，4’－1%的氯化铝溶液4mL摇匀，再加水至刻度，摇匀;以水［3］邻二羟经基部位。有文献报道有邻二酚羟基结构的非加相应显色剂为空白，于272nm处测定，以吸光度(A)黄酮类成分原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸也可与为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，结果回归NaNO2、AI(NO3)3、NaOH试剂反应产生红色物质，并在500方程为:A=0.0397C+0．0567，r=0．9996，芦丁对照品nm左右有最大吸收或有较强吸收。而黄酮类成分黄芩素、在浓度为5．1467～30．8802μg/mL范围内与吸光度呈山奈酚等在500nm左右几乎无吸收。足以说明以芦丁为现良好线性关系。对照品，以NaNO2、Al(NO3)3、NaOH为显色剂测定总黄酮2．2．6精密度试验精密量取芦丁对照品溶液、山楂叶提的方法无专属性。［5］取物供试品溶液各2mL，分置10mL容量瓶中，分别加入马陶陶等研究表明，芦丁与A1C13发生显色反应，生1%的氯化铝溶液4mL摇匀，再加水至刻度，摇匀;选用相成黄色络合物;AlCl3的显色反应主要发生在3位羟基、4位应的空白对照，于272nm处测定吸光度，连续测定6次，并羰基和邻二酚羟基，只存在5位羟基、4位羰基时黄酮类物计算RSD值，结果芦丁、山楂叶提取物的RSD值均为质与AlCl3不发生反应。实验对几种常见的多酚类化合物0.14%。表明，仪器精密度良好。紫外光谱图进行了扫描，结果表明对于含邻二酚羟基的非2．2．7稳定性试验精密量取芦丁对照品溶液、山楂叶提黄酮化合物:2，3－二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原取物供试品溶液各2mL，分置10mL容量瓶中，分别加入酸，A1C13显色前后在270nm左右均没有吸收峰，消除了1%的氯化铝溶液4mL摇匀，再加水至刻度，摇匀;选用相非黄酮类化合物对显色的干扰，因此采用A1C13比色法测应的空白对照，分别于0、5、10、30、45、60、90、120min，在定中药总黄酮的含量具有合理性和专属性。272nm处测定吸光度，计算RSD值，考察稳定性。结果芦本文采用NaNO2－AI(NO3)3－NaOH和A1C13两种显丁、山楂叶提取物的RSD值分别为0．80%，0．67%，表明其色系统，以芦丁为对照，采用比色法测定山楂叶提取物中总在显色后的120min内稳定性均较好。黄酮的含量，结果以NaNO2－AI(NO3)3－NaOH显色法2．2．8重现性试验取山楂叶提取物约100mg，共6份，(510nm)测定含量为86．15%，A1C13显色法(272nm)测定含量为35．19%，两种方法所得测定结果相差较大，但对于精密称定，按2．22．项下的方法制备山楂叶提取物供试品何种方法更适合用于山楂叶提取物中总黄酮的测定还有待溶液;精密量取上述供试品溶液各2mL，分置10mL容量进一步研究。瓶中，分别加入1%的氯化铝溶液4mL摇匀，再加水至刻参考文献:度，摇匀;于272nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结［1］赵焕谆．中国果树志(山楂卷)［M］．北京:中国林业出版社，果:山楂叶提取物中总黄酮的平均含量为35．13%，RSD值1996:28－32．中为1．69%;表明该方法重复性好。［2］徐礼．中草药有效成分分析法(下册)［M］．北京:人民卫生出华2．2．9加样回收率试验在已知总黄酮含量的山楂叶提中版社，1984:69－70．取物供试品溶液中加入一定量的芦丁对照品，按2．2项下［3］郭亚建，范莉，王小强，等．关于NaNO－Al(NO)－NaOH医233药的方法制备供试品溶液，制备6份平行样品;精密量取上述比色法测定总黄酮方法的探讨［J］．药物分析杂志，2002，221151供试品溶液各2mL，分置10mL容量瓶中，分别加入1%(2):97－99．1151的氯化铝溶液4mL摇匀，再加水至刻度，摇匀于272nm处［4］刘立群．有机理论与药物分析［M］．北京:人民卫生出版社，学测定吸光度，计算回收率．结果:山楂叶提取物供试品溶液1984:344－345．刊中总黄酮的平均回收率分别为99．71%，RSD值为1．29%，［5］马陶陶，张群林，李俊，等．三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨［J］．时珍国医国药，2008，19(1):54－56．见表4;表明该方法准确性较好。'