比光谱_导数分光光度法同时测定对_香豆酸和阿魏酸

'※分析检测食品科学2010,Vol.31,No.08189比光谱-导数分光光度法同时测定对-香豆酸和阿魏酸赵健，欧仕益*(暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东广州510632)摘要：根据对-香豆酸和阿魏酸的紫外吸收特点，确立得到两种酚酸稳定的紫外吸收图谱的条件，建立比光谱-导数分光光度法，同时测定对-香豆酸和阿魏酸的含量。在溶剂为乙醇或水或乙醇与水的混合溶液时，调节溶液pH2.0，得到两种酚酸稳定的紫外吸收光谱图，最大吸收峰分别为对-香豆酸308nm、阿魏酸320nm。运用比光谱-导数分光光度法测定对-香豆酸和阿魏酸的二元混合物，回收率在93.40%～103.34%之间，结果良好。对蔗渣碱解提取的酚酸样品进行检测，阿魏酸检测受影响较大，而对-香豆酸检测结果较理想。本法对波谱严重重叠的两种酚酸能进行有效测定，关键词：比光谱-导数分光光度法；对-香豆酸；阿魏酸SimultaneousDeterminationofp-CoumaricAcidandFerulicAcidUsingRatioSpectraDerivativeSpectrophotometryZHAOJian，OUShi-yi*(DepartmentofFoodScienceandEngineering,CollegeofScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)Abstract：Aratiospectraderivativespectrophotometricmethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationofp-coumaricacidandferulicacid.p-coumaricacidandferulicaciddissolvedineitherethanol,wateroranethanolaqueoussolutionwithpHadjustedtobe2.0exhibitedstablemaximumabsorptionat308nmand320nm,respectively.Spikerecoveriesforbothacidswerewithintherangeof93.40%－103.34%.Inthedeterminationofp-coumaricacidandferulicacidbythismethodinphenolicacidsextractedfromsugarcaneresidue,thepresenceofothersubstanceshavinganobviousspectralabsorptionatwavelengthscloseto308nmledtoalargeerrorofp-coumaricaciddeterminationbutaccuracydeterminationresultsofferulicacidwereobtained.Thismethodprovidesanapproachtotheeffectivedeterminationofp-coumaricacidandferulicacid,betweenwhosespectra,thereisalargeoverlap.Keywords：ratiospectraderivativespectrophotometry；p-coumaricacid；ferulicacid中图分类号：O657.3文献标识码：A文章编号：1002-6630(2010)08-0189-05对-香豆酸(p-coumaricacid)和阿魏酸(ferulicacid)是在对-香豆酸与阿魏酸的提取过程中，形成二者的植物中普遍存在的两种酚酸[1]。对-香豆酸具有很好的抗混合物不可避免。对于对-香豆酸与阿魏酸的混合物，氧化活性，对过氧化氢、超氧阴离子自由基、羟自由以及多种酚酸混合物乃至其他光谱有吸收重叠的多组分基、过氧化亚硝基有强烈的清除作用[2]，还具有镇痛、混合物的定量分析，多采用色谱法[5]，如广泛应用的薄镇静的作用，有抗菌、抗突变活性[3]。阿魏酸可清除层色谱法、高效液相色谱法[6]等，这两种方法是在把混自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠合物分离的基础上进行定量分析，准确度和分辨率高，心病、抗菌消炎、止痛、抗突变和防癌、增强精子重现性好。但是，正是由于需要对多组分混合物的预活力以及调节人体免疫功能[4]。目前对-香豆酸和阿魏酸先分离，使得方法繁琐、分析时间较长且仪器昂贵。在医药、食品、化妆品等领域的应用越来越广泛。紫外-分光光度法具有仪器简单、操作方便快捷、收稿日期：2009-06-23基金项目：广东高校科技成果产业化重大项目(cgzhzd0709)作者简介：赵健(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品。E-mail：janezhao85@hotmail.com*通信作者：欧仕益(1963—)，男，教授，博士，研究方向为功能性食品。E-mail：tosy@jnu.edu.cn 1902010,Vol.31,No.08食品科学※分析检测测定范围广、分析速度快等优点[7]。对于不经分离、直1.2.4比光谱-导数分光光度法的建立接同时测定吸收光谱严重重叠的多组份体系中各组份含汤晓东等[10]在Salinas等[8]提出的比光谱-导数分光光量的研究，一直是该领域的热门课题。比值导数分光度法的基础上提出了计算方法。根据方法的原理，本光度法是20世纪90年代初，Salinas等[8]提出的一种新实验建立的比光谱-导数分光光度法的具体操作为[11-13]：的光谱分析方法。对光谱严重重叠的二组分、三组分①分别把FA:w-w体系与CA:w-w体系得到的质量浓度体系的测定，该方法更为有效，与普通分光光度法相为2、4、6、8、10μg/mL的紫外吸收光谱作为计算比，它具有分辨能力强、灵敏度高等特点[9]。用标准光谱值；②把2μg/mL的对-香豆酸和阿魏酸溶本实验旨在应用比光谱-导数紫外分光光度法测定液的标准光谱值作为除数因子，分别用阿魏酸和对-香蔗渣碱提酚酸类化合物的含量，通过初步确定最佳检测豆酸的标准光谱值与除数因子做比值，得到比光谱图；条件，建立比光谱-导数分光光度法测定混合提取物中③以Δλ＝6nm为波长间隔对比光谱值进行求导，得到对-香豆酸和阿魏酸的含量，为今后实验、生产提供便比光谱导数图；④从比光谱导数图形中选择比导数峰，利，也为该方法的实际运用提供参考。分别为255nm和238nm，即在252、258nm处测定香豆酸标准溶液的吸光度，在235、241nm处测定阿魏酸标1材料与方法准溶液的吸光度；⑤按照式(1)、(2)计算对-香豆酸和阿1.1材料与仪器魏酸的比值导数D：1DCA对香豆酸、阿魏酸标准品Sigma公司；蔗渣广255=(ACA,258/A°FA,258－ACA,252/A°FA,252)/6(1)1DFA东省海侨糖厂。238=(AFA,241/A°CA,241－AFA,235/A°CA,235)/6(2)式中：以1DC无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等(均为分析纯)。A255为例：D表示比导数值；左肩标UV-9200紫外-可见分光光度计北京瑞利分析仪器1表示比导数阶数；右肩标CA表示被测组份；右脚标公司；SHIMADZMLC-20AT高效液相色谱分析系统(柱255表示比导数光谱峰对应的波长，即测定波长252nm子EclipseXDB-C18，4.6mm×250mm×5μm)日本岛津和258nm的中间波长。以A°FA,238为例：A°表示作为除仪器公司。数因子的标准吸光度值；右脚标FA表示被测组份；右1.2方法脚标238表示比导数光谱峰对应的波长。由此可得到比导数值D与质量浓度C的标准曲线回1.2.1标准溶液的配制归方程。采用阿魏酸、对-香豆酸标准品分别配制质量浓度为1.0mg/mL的以乙醇为溶剂的标准溶液和以0.1g/100mL1.2.5回收率实验NaOH溶液为溶剂的标准溶液。为了验证检测方法在不配制阿魏酸与对-香豆酸标准品不同浓度的混合溶同条件下的适应性，再按表1将两类不同的标准溶液配液，在4个波长处测定混合溶液吸光度，然后按照式制成不同样品液。(1)、(2)计算比导数值D，再根据标准曲线回归方程计算相应阿魏酸和香豆酸的含量，计算回收率。1.2.2紫外检测对样品1和样品2的各个标准样品溶液在波长200～1.2.6样品中阿魏酸和香豆酸含量的检测样品溶液的提取[14]：蔗渣与4g/100mLNaOH溶液400nm范围内，每间隔1nm进行扫描。按1:15(m/V)混合，常温下碱解15h，样品过滤，过3000D1.2.3对-香豆酸和阿魏酸的标准曲线回归方程的建立超滤膜，收集滤出液。确立最佳检测溶剂及pH值后，在该条件下，建立1.2.7HPLC方法检测阿魏酸和对-香豆酸的含量[15]对-香豆酸和阿魏酸的标准曲线回归方程。表1各种检测溶液的配制Table1Preparationofp-coumaricacidandferulicaciddissolvedin1.0mg/mLethanolaqueoussolutionor0.1%sodiumhydroxidesolution名称初步定容样品1样品21.0mg/mL的FA用乙醇分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(FA：a-a体系)乙醇标准溶液用水分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(FA：a-w体系)阿魏酸(FA)1.0mg/mL的FA-0.1g/100mL水稀释至5μg/mL，用HCl用乙醇分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(FA：w-a体系)NaOH标准溶液溶液调节pH值分别为1～13用水分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(FA：w-w体系)1.0mg/mL的CA用乙醇分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(CA：a-a体系)对-香豆酸(CA)乙醇标准溶液用水分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(CA：a-w体系)1.0mg/mL的CA-0.1g/100mL水稀释至5μg/mL，用HCl用乙醇分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(CA：w-a体系)NaOH标准溶液溶液调节pH值分别为1～13用水分别稀释至2、4、6、8、10μg/mL(CA：w-w体系) ※分析检测食品科学2010,Vol.31,No.08191色谱条件：色谱柱EclipseXDB-C18(4.6mm×乱无章。整体来看，FA与CA在a-a体系时峰形稳定，250mm)，流动相为体积比为72:38的冰醋酸-甲醇，检浓度线形比例好，是用来制作标准曲线回归方程测定含测波长为313nm，流速1mL/min，柱温40℃，进样量量的理想条件。但实际情况是，在提取过程中不可避10μL。以保留时间定性，面积归一法计算相对含量。免会有水溶液存在的情况，例如，本实验小组采用碱解的方式提取酚酸。此时，无法在a-a的环境下测定酚2结果与分析酸含量。为了解决这一问题，结合pH值影响的实验结果可观察到，在酸性条件下得到的峰形、最大吸收峰2.1pH值对紫外吸收光谱图的影响位置与a-a体系下的结果一致。并且，在理论上分析，2.01.8酸性条件与乙醇条件下，酚酸都呈游离态，得到同样1.61.4的吸收光谱也属必然。由此，初步确定，在完全乙醇231.2678121.05113条件下或是酸性条件下检测酚酸含量才能保证实验的准吸光度0.894110.610确性与重现性。0.40.21.002002202402602803003203403603804000.823波长/nm10.64图1对-香豆酸在不同pH值的紫外吸收光谱图吸光度0.4Fig.1Absorptionspectraofp-coumaricacidsolutionsat0.2differentpH02002202402602803003203403603804002.01.8波长/nm1.61.4111.a-a体系；2.a-w体系；3.w-a体系；4.w-w体系。下同。1.2131.0324图3阿魏酸(8μg/mL)在不同溶剂体系(表1)中的紫外吸收光谱图76512吸光度0.881Fig.3Absorptionspectraofferulicaciddissolvedindifferent0.69100.4solventsat8μg/mLlevel0.202002202402602803003203403603804001.0波长/nm0.8312图2阿魏酸在不同pH值的紫外吸收光谱图0.6Fig.2AbsorptionspectraofferulicacidsolutionsatdifferentpH4吸光度0.40.2从样品1的紫外扫描结果图1、2可以看出，pH值0200220240260280300320340360380400对酚酸的紫外吸收影响非常大，但这些影响也是有规律波长/nm可循的。在酸性条件下(pH值为1～3)，图谱形状比较图4对-香豆酸(8μg/mL)在不同溶剂体系(表1)中的紫外吸收光谱图稳定；中性条件或接近中性条件时(pH值为5～9)，图Fig.4Absorptionspectraofp-coumaricaciddissolvedindifferent谱出现紫移现象；而碱性条件时(pH值为11～13)，出solventsat8μg/mLlevel现强烈的红移，且对于阿魏酸来说，吸收强度显著增强。分析原因，酸性条件下，酚酸呈游离态，因此，进一步实验证明，CA与FA在w-w体系以及a-w体吸收光谱较为稳定；而碱性条件时，羧基与酚羟基被充系时，用盐酸调节pH2.0后定容，进行紫外全波长扫分解离，增加了共轭效应，因而出现红移且增加吸收描，得到的图谱完全一致。同时还表明，即使采用乙强度[7]。但是，中性条件下为何会出现紫移的现象，还醇提取酚酸，也可以用水来稀释测定其含量，只要保需进一步研究。证pH2.0。由此，建立对-香豆酸和阿魏酸的紫外-分2.2溶剂影响光光度法定量分析条件为：样品可以在乙醇或pH2.0的对样品2各组溶液进行紫外扫描，以质量浓度为水溶液中进行检测，香豆酸检测波长为308nm，阿魏酸8μg/mL的香豆酸和阿魏酸在不同溶剂中的紫外吸收光谱检测波长是320nm。得到的标准曲线回归方程分别为：CA：y=0.1297x－0.0037，R2＝0.9999图为例，从图3、4可以看出，溶剂对最大吸收峰的位置、峰形以及吸收强度都有非常显著的影响。其他质FA：y=0.0938x－0.0005，R2＝0.9994量浓度的样品同样由于溶剂的影响使得紫外吸收图谱杂2.3香豆酸与阿魏酸混合物中同时测定各组分含量 1922010,Vol.31,No.08食品科学※分析检测2.3.1除数因子的选择处的吸光度，根据式(1)、(2)计算相应的比导数值D，再作为除数因子的标准溶液质量浓度大小对比导数值将比导数值代入回归方程计算出质量浓度C的值。具体的准确性和方法的灵敏度有明显影响。根据汤晓东等[10]数据见表3。采用推算得到的1μg/mL的标准光谱值作为除数因子的方法，本实验采用直接测量得到的2μg/mL的标准光谱值表2对-香豆酸和阿魏酸的标准曲线回归方程作为除数因子。Table2Regressionequationsofdeterminationsofp-coumaricacidandferulicacid2.3.2求导用波长间隔以及测定波长的选择组分质量浓度范围/(μg/mL)回归方程相关系数若Δλ过小，则噪音干扰较大；若Δλ过大，则求CA2.01～10.05D=0.0407C＋0.0006R2=0.9999FA2.02～10.10D=0.1427C＋0.0084R2=0.9994导结果偏离较大，实验证明，选择Δλ=6nm比较合理。根据比光谱导数图的导数峰(图5、6)分别对-香豆酸和阿魏酸选择比导数峰255nm和238nm，确定相应的测定表3回收率测定实验结果波长分别为252、258nm和235、241nm。Table3Spikerecoverytestforp-coumaricacidandferulicaciddeterminedbythismethod2.3.3标准曲线回归方程的建立标准加入量/(μg/mL)对-香豆酸质量浓度阿魏酸质量浓度CAFA计算值/(μg/mL)回收率/%计算值/(μg/mL)回收率/%1.00.81.019.040.925292.529.0045100.720.60.45.059.044.854697.099.0210100.230.29.099.049.0990101.108.956199.510.0－0.22002202402602803003203403603804003.037.032.801993.406.893198.47比导数值－0.47.077.036.947499.256.670095.28－0.6－0.85.055.024.855497.114.821796.43－1.09.095.029.0210100.234.854697.09波长/nm3.033.013.0516101.723.1003103.34图5对-香豆酸比光谱导数图7.073.016.977199.673.0404101.35Fig.5Ratioderivativespectraofp-coumaricacid9.091.009.0302100.341.0794107.944由表3可见，该方法同时测定对-香豆酸与阿魏酸3二元混合物质量浓度的准确度较好。除去各自在1.0021μg/mL时检测回收率偏差较大，其他回收率均在93.40%～0比导数值103.34%之间。－1200210220230240250260270280290300－22.4提取样品中阿魏酸和对-香豆酸含量的检测－3从甘蔗渣提取的酚酸样品按照上述方法测4个波长波长/nm吸光度值，计算对-香豆酸和阿魏酸的含量，并同时用图6阿魏酸比光谱导数图Fig.6RatioderivativespectraofferulicacidHPLC方法检测对-香豆酸和阿魏酸的含量，结果如表4所示。分别检测质量浓度为2、4、6、8、10μg/mL的对-香豆酸在252、258nm波长处的吸光度，按照式(1)表4样品中对-香豆酸与阿魏酸含量的测定结果Table4Theconcentrationsofcoumaricacidandferulicacidin计算比导数值D，得到对-香豆酸比导数值D与质量浓samples度C的标准曲线，进而得到回归方程。同理检测质量CA含量/(mg/mL)FA含量/(mg/mL)浓度为2、4、6、8、10μg/mL的阿魏酸在235、241nm处理比导数法HPLC比导数法HPLC波长处的吸光度值，按照式(2)计算比导数值D，得样液1.37011.28401.13400.0852到阿魏酸比导数值D与质量浓度C的曲线，进而得到样液+2mgFA1.30993.1023样液+0.4mgCA+2mgFA1.80742.9320回归方程，即阿魏酸与对-香豆酸的二元混合物体系两种物质含量同时被测定时使用的标准曲线回归方程，见表2。由表4可知，该方法对样品中香豆酸含量的测定较2.3.4回收率实验为准确，而对阿魏酸的测定，本身方法是准确的，但配制不同质量浓度的对-香豆酸与阿魏酸的混合溶是，可能由于样品中其他杂质在测定阿魏酸时所检测的液，每个样品测定235、241、252、258nm4个波长波长范围有紫外吸收，干扰了阿魏酸的检测，因而造 ※分析检测食品科学2010,Vol.31,No.08193成非常大的偏差。虽然如此，本实验中观察到由HPLCferulicandp-coumaricacidsinsugarcanebagasse[J].AnalyticaChimicaActa,2005,552:207-217.检测到的阿魏酸的含量非常的低，因此，完全可以把[2]赵春贵,张立伟,王晖.肉桂酸及其衍生物抗氧化活性研究[J].食品对-香豆酸作为目标物质，以对-香豆酸的含量作为指科学,2005,26(1):218-222.标，进行下一步分离纯化工艺的选择和优化。[3]陈惠芳.植物活性成分辞典:第二册[M].北京:中国医药科技出版社,2001:386-388.3结论[4]欧仕益,包惠燕,蓝志东,等.阿魏酸及其衍生物的药理学作用研究进展[J].中药材,2001(3):220-221.3.1由于溶剂和pH值对阿魏酸和对-香豆酸的紫外吸[5]ROBBINSJR.Phenolicacidsinfoods:anoverviewofanalyticalmethodology[J].JournalofAgricultureandFoodChemistry,2003,51收光谱影响较大，因此，通过实验确立了光谱图稳定、(10):2866-2877.准确性高、重现性好且质量浓度与吸光度具有良好线性[6]AMAROWICZR,WEIDNERS.Contentofphenolicacidsinray关系的检测条件：溶剂为乙醇或水或乙醇与水的混合溶caryopsesdeterminedusingDAD-HPLCmethod[J].CzechJournalofFoodScience,2001,19(6):201-205.液，调节pH2.0，对-香豆酸检测波长为308nm，阿魏[7]陈国珍,黄贤智,刘文远,等.紫外-可见分光光度法[M].北京:原子酸检测波长是320nm。能出版社,1983:167-174.3.2建立了比光谱导数法，对对-香豆酸与阿魏酸二元[8]SALINASF,BERZASNEVADOJJ,ESPINOSAMA.Anewspectrophotometricmethodforquantitativemulticomponentanalysis混合体系中二者的质量浓度进行同时测定，回收率在resolutionofmixturesofsalicylicandsalicyluricacids[J].Talanta,1990,93.40%～103.34%之间。对提取样品中对-香豆酸和阿魏37(3):347-351.酸的含量进行同时检测，对主要成分对-香豆酸含量的[9]徐嘉凉,汤晓东.比光谱-导数吸光光度法及其应用与进展[J].理化检验:化学分册,2002,38(7):374-377.测定准确性较好。[10]汤晓东,孙红霞,陈明,等.比光谱-导数分光光度(计算)法同时测定3.3通过实验也发现了该方法的一些局限性：①该方邻硝基酚、间硝基酚或对硝基酚二元混合物的含量[J].石油化工,法的应用前提为已知混合样品中的两种或两种以上目标2001,30(6):471-474.[11]倪永年,周小群,邱萍.比值-导数法同时测定污水中的苯酚和苯胺物质，通过运用这些物质的标准品建立回归曲线进而对[J].光谱学与光谱分析,2004,24(1):118-121.其他实验样品中的目标物质进行检测；②若样品成分非[12]IDRISSKA,SEDAIRAH,AHMEDSS.Determinationofstrontium常复杂，存在未知的具有紫外吸收的物质，则有可能andsimultaneousdeterminationofstrontiumoxide,magnesiumoxideandcalciumoxidecontentofPortlandcementbyderivativeratio对检测造成干扰。如本实验中阿魏酸的检测偏差较大。spectrophotometry[J].Talanta,2009,78(1):81-87.3.4总体来看，该方法仪器简单，操作方便，分析[13]刘慧.多组分定量分析的迭代优化-紫外分光光度法的研究[D].青快速，准确性高，为今后的实验提供了极大的便利，岛:中国海洋大学,2006.[14]OUShiyi,LUOYanlin,XUEFe.Seperationandpurificationofferulic也为比光谱-导数分光光度法这种分析方法在实际中的运acidinalkaline-hydrolysatefromsugarcanebagassebyactivatedcharcoal用提供参考。adsorption/anionmacroporousresinexchangechromatography[J].Jour-nalofFoodEngineering,2007,78(4):1298-1304.参考文献：[15]OUShiyi,LUOYanlin,HUANGCaihuan,etal.Productionofcoumaricacidfromsugarcanebagasse[J].InnovativeFoodScienceandEmerging[1]FENGXu,SUNRuncang,SUNJinxia,etal.DeterminationofcellwallTechnologies,2009,10(2):253-259.'