分光光度法测定天然维生素E总含量

'粮油食品科技第13卷2005年第4期质量控制分光光度法测定天然维生素E总含量122刘
云,丁霄霖,胡长鹰(1.浙江省农科院国家大豆改良分中心,浙江杭州
310021;2.江南大学食品学院,江苏无锡
214036)

摘
要:对VE含量测定的快速方法分光光度法进行了比较详细的探讨。确定了测定时的最大吸收波长在510nm处,显色反应产物吸光值在0~0.8范围内与样品中VE浓度呈线性相关,标准曲线y=0.0096x-0.0047,相关系数为0.9984,方法平均回收率为97.02%,变异系数为1.34%,-6最小检测浓度为1.228010mol/L。分光光度法与HPLC法测定结果相比较,最大相对偏差不高于5%。关键词:分光光度法;维生素E;高效液相色谱法中图分类号:O657.32,Q566
文献标识码:A
文章编号:1007-7561(2005)04-47-03DeterminationofnaturalvitaminEcontentwithspectrophotometry122LIUyun,DingXiao
lin,HuCHANG
ying(1.HangzhouSub
centerofNationalSoybeonImprovementofZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou
310021;2.SchoolofFoodScienceandTechnologyofSouthernYangtzeUniversity,Wuxi
214036)Abstract:SomecriticalparametrersinUV-spectrophotometrytodeterminenaturalvitaminEcontentaredis
cussedcomprehensively.Thewavelengthwheretheproductofreactiondisplaysmaximumabsorptionisdeter
2minedat510nm,thelinearrangeis0~78.91%
g/mL,andthelinearequationisy=0.0097x-0.0047,r=0.9984.Themaximumrelativedeviationisbelow5%whencomparedwithHPLC.Keywords:UV-spectrophotometry;VitaminE;HPLC

天然VE(NaturalVitaminE)又称天然抗不孕维

UV755B紫外-可见分光光度仪:上海精密科学生素、生殖维生素、天然生育酚等,是一种性能优良仪器有限公司(分析仪器总厂制造)。的细胞内抗氧化剂及天然营养剂,兼具生物活性高、AB104-N型电子分析天平:上海mettler-toledo安全性高、易被人体吸收等特点,广泛应用于医药、装置有限公司,感量0.1mg。保健品、食品、化妆品等诸多领域,是一种极具市场高效液相色谱仪:日本日立公司产品。前景的热门产品。目前,关于天然VE的分析测定方1.2
试剂!1∀!2∀!3∀法主要有铈量法、色谱法、荧光分析法等。由标准DL

生育酚:sigma公司产品,纯度大于于天然VE浓缩液中含有一些具有还原性的物质,有98%;可能在铈量法中参加反应,导致VE含量测定结果高无水乙醇:上海振兴化工一厂,AR级;于其在产品中的实际含量,因此铈量法测定VE含三氯化铁:中国医药(集团)上海化学试剂公司,量,无法保证其特异性及准确性,且操作繁琐,时间AR级;长。色谱法测定VE含量虽具有高效、准确的优点,磷酸:中国医药(集团)上海化学试剂公司,AR级;但操作要求高、时间长且测试费用昂贵。荧光法测1,10-菲绕啉:中国华东师范大学化工厂,AR级。定VE含量,需要防止样品中某些干扰荧光强度的物1.3
原理质的存在;另外,如果样品中VA含量较高时会产生生育酚还原三价铁离子成二价铁离子,而二价荧熄灭现象而严重干扰测定。本着操作简便、准确、铁离子与1,10-菲绕啉产生有色反应,于某一波长快速、科学的原则,我们对分光光度法测定天然VE下具有最大吸收。在一定浓度范围内,其吸收值与含量进行了较为系统的研究。生育酚含量成正比。1
材料与方法1.4
方法1.1
仪器于50mL棕色容量瓶中,加入适量的VE配成标收稿日期:2004-01-05准溶液,用无水乙醇定容至刻度,使其吸光度在0.2作者简介:刘云(1972-),男,湖南道县人,博士生.~0.8之间。分别取0.4、0.7、1.0、1.3、1.7、2.0mLVE标准液放入6只试管中,用无水乙醇定容至#

质量控制粮油食品科技第13卷2005年第4期3.5mL,依次加入0.5mL6.0013mmol/L的菲绕啉、表2
显色剂浓度对测定结果的影响0.5mL1.0011mmol/L的FeCl3溶液,显色15s后立即显色剂浓度(mmol/L)OD510nm4.0260.341加入0.5mL4.0125mmol/L的H3PO4溶液中止显色,5.2970.350以相应的试剂空白为参比,用1cm石英比色皿,在6.0800.352510nm波长处测定吸光度,制作标准曲线。样品VE6.9920.3458.8290.347含量的测定步骤类似。10.7360.3462
结果与讨论2.1
最大吸收波长的确定2.4
反应物三氯化铁浓度对测定结果的影响图1是在可见光区450~550nm范围内于分光从表3中可以看出,反应物三氯化铁的浓度太光度计上得到的三种不同浓度的样品吸收光密度值高或太低都对测定结果有很大的影响。浓度太高,与波长的关系。由此可见,在510nm处显色反应产反应完全后,过剩的三氯化铁对反应产物的显色造物具有最大吸收值。因此,用分光光度法测定样品成干扰;浓度太低,容易造成VE反应不完全,致使测中VE的含量,其吸收波长应选择在510nm。定结果不准确。经多次实验发现,三氯化铁的浓度在1mmol/L时,制作标准曲线和测定的结果最准确,所以实验中,反应物三氯化铁的浓度保持在1mmol/L。表3
三氯化铁浓度对测定结果的影响反应物浓度(mmol/L)OD510nm0.46430.2961.00010.3401.39290.3651.85720.3842.32150.3953.25010.412图1
分光光度计上OD-关系2.2
反应时间对光密度值的影响2.5
磷酸浓度对测定结果的影响对于分光光度法,必须使显色反应完全后才能分光光度法测定天然VE含量时,磷酸的作用是进行OD值的测定。如果反应不完全,测定结果将中止显色反应的进行。其浓度自然对测定结果有一明显偏低。在不影响实验结果的前提下,反应时间定的影响。研究发现磷酸浓度在40mmol/L左右时,越短则该法应用起来就越方便。实验研究发现,在标准曲线的制作及方法重现性最佳。反应15s后进行比色,其结果相差不大,结果见表1。2.6
显色反应物稳定性由表1可知,当反应时间超过15s后,显色反应物的如果显色反应产物不稳定,在空气中静置褪色光密度值基本保持不变,故而反应时间确定为15s。较快,则不宜用分光光度法来测定其含量。由此用表1
反应时间对结果的影响反应时间(s)OD510nm显色反应物静置一定时间后测定其光密度值来表征120.342显色反应产物的稳定性,结果见表4。130.348由表4可知,显色反应还是比较稳定的,褪色现150.352象也不明显,显色反应后加入中止反应物磷酸,摇匀200.352260.353立即测定与静置1个多小时后测定,其光密度值变630.352化不大。从表4中还可以知道,不同质量浓度VE样品与显色剂发生显色反应后,其产物都比较稳定。2.3
1,10-菲绕啉显色剂浓度对测定结果的影响前人在研究中发现,显色剂浓度对分光光度法表4
显色反应物稳定性测定VE含量有很大的影响。作者在研究中也发现,静置时间测定样品的质量浓度/(
g/mL)(min)11.2716.9122.55以菲绕啉作显色剂,其浓度在6mmol/L左右,反应产00.2220.2900.385物的光密度值最大,结果见表2。由表2可得,一般300.2200.2890.384测定天然VE时,显色剂的浓度应使反应产物在此浓580.2220.2900.381度下其吸收值最大,所以显色剂浓度应控制在740.2230.2880.381850.2230.2900.3836mmol/L左右为宜。#

粮油食品科技第13卷2005年第4期质量控制2.7
操作顺序对测定结果的影响--生育酚为标准运用面积归一化来进行,然后计分光光度法测定样品中VE的含量,一般操作顺算总VE含量与分光光度法进行比较。HPLC分析条序是先加入显色剂菲绕啉,混匀,再加入反应物三氯件见表6,HPLC测定结果与分光光度法比较见表7。化铁发生显色反应15s后,立即加入中止反应的物质磷酸,混匀。最后在分光光度计上测定有色溶液的光密度值。即显色剂∃反应物∃中止反应的物质∃测定(%)。如果改变显色剂加入的顺序,按显色剂∃反应物∃中止反应的物质∃测定(&);显色剂∃反应物∃中止反应的物质∃测定(∋)两种方式来操作,其测定结果相差很大。测定结果见表5。表5
操作顺序对测定结果的影响操作顺序OD510nm图3
分光光度法测定VE标准曲线%0.3380.3370.338表6
天然VE的HPLC分析装置与方法&0.3330.3340.334型号HITACHI高效液相色谱仪∋0.0480.0450.046分析柱HYPERSILSI5
m200mm4.6mm硅胶柱流动相正己烷:异丙醇=99:1,温度25(,流速1mL/min665AVariablewavelengthUVmintor,检测波长295nm。2.8
线性范围的确定检测器N-2000双通道色谱工作站(浙江大学制造)文献上对于分光光度法测定天然VE的线性范围泵日立665A-12报道很少,作者在这方面作了一点研究,结果见图2。进样体积5
LDL--生育酚标样:购于SIGMA公司,!(DL--生标样育酚)>98%表7
分光光度法与HPLC法测定结果的比较HPLC分光光度法相对偏差测定次数(%)(%)(%)17.8787.5224.51927.8777.5174.57037.8787.5304.417由表7可知,分光光度法测定样品中VE含量比HPLC法略偏低,其相对偏差没有超过5%,基本上图2
VE测定线性范围的确定可以满足样品VE含量测定的需要。由图2可知,样品中VE浓度在3~90
g/mL之3
小结间,光密度值与VE浓度基本上成直线关系。所以初分光光度法测定样品中VE含量,最大吸收波长步确定该法测定VE的线性在3~90
g/mL。在510nm处,按本文操作(%)的顺序操作,显色反应2.9
方法的准确度、精密度及最小检出限产物比较稳定,1h后测定其光密度值基本没有变用浓度为39.36
g/mL的VE标准溶液配置系列化。按照本文所述测定条件测定VE含量,显色反应浓度标准VE液,使VE浓度在0~78.9
g/mL范围产物吸光值在0~0.8范围内与样品中VE浓度成线内,依照上述方法,按最佳实验条件下制作VE标准性相关,相关系数为0.9984。分光光度法与HPLC曲线(如图3),得到回归方程y=0.0096x-0.0047,法测定结果相比较,最大相对偏差不高于5%。运相关系数为0.9984,其中y表示吸光度,x表示VE用分光光度法测定样品中VE总含量,简单、快速,准的质量浓度。方法的准确度以回收率进行检验,测确度也较好,同时对仪器要求不高,是一种较好的测量5次,平均回收率为97.02%,精密度的检验是通定VE含量方法。过对9.92
g/mL的VE样品进行7次重复测定,得到参考文献:变异系数为1.34%,最小检出限是依据公式C=!1∀张乃明,陈艺青.铈量法测定VE粉含量的探讨!J∀.兽药与饮料添!4∀加剂,2002,7(1):11-12.3s/bC标准计算得到的,结果为1.2280!2∀陈红,吴缨.天然维生素E异构体中-生育酚的气相色谱分析-610mol/L(测定次数n=15)。同时该方法与HPLC!J∀.生物学杂志,2002,19(3):37-38.法进行了比较。!3∀李艳飞,王振勇,石炭庆,张立春.饲料中VE的荧光测定!J∀.黑龙江畜牧兽医,2001,(2):18-19.将一定量的样品溶于正己烷中,按表6条件进!4∀邢志,陈培榕,刘芳.测定维生素E的分光光度法研究!J∀.现代仪行HPLC分析。维生素E各异构体的计算以纯DL器,1999(4):19-21.完)#
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