可见分光光度法测定水华鱼腥藻

'第21卷第3期华中农业大学学报Vol.21No.32002年6月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJune2002,295～2973可见分光光度法测定水华鱼腥藻1)1)1)2)胡先文董元彦张新萍叶发兵(1)2)华中农业大学理学院,武汉430070;黄冈师范学院化学系,黄冈438000)摘要采用可见分光光度法测定水华鱼腥藻(Anabaenaflos2aquae)藻液的吸光度A。这种方法与细胞计数法、叶绿素a含量测定法和荧光分光光度法相比较,既简便又准确,且可获得十分理想的线性相关性,其测得的A值可以作为水华鱼腥藻现存量的指标。关键词水华鱼腥藻;测定;可见分光光度法+中图法分类号Q949.221近年来随着工业废水和生活污水大量排入天然灯连续光照,并用气泵不断地向藻液中鼓入空气。水体,我国部分水域,特别是主要湖泊发生水华的频1.3水华鱼腥藻现存量的测定方法率越来越高,带来的经济损失越来越大。研究和防取长势良好的藻种,用培养基SE配制成4组完治水华成为目前环境保护工作的一项重要内容。本全相同的藻液,每组有体积均为50ml、5个不同水试验所研究的水华鱼腥藻是夏季引起水华最为常见平倍增藻密度的藻液,分别采用4种不同的测定方的一种蓝藻,该藻具有易于培养、对毒性敏感等特法测定藻现存量。[1][2][3,4]点,对其研究有很大的理论和实际价值。对该1)细胞计数法。将藻液充分摇匀,准确吸藻现存量的测定是研究的一项基础,具有十分重要取0.1ml,置于容量为0.1ml、表面积为20mm×20的作用。目前采用的基本测定方法有细胞计数法、mm的计数框内,盖上盖玻片,用40×10倍显微镜观[1,3,4]叶绿素a含量测定法。文献中报道的测定方测计数至少10个视野,计算各藻液的细胞密度平均[5,6]法还有荧光分光光度法和可见分光光度法,但值。[3,4,7,8,]对后两种测定方法的准确性及与基本测定方法之间2)叶绿素a含量测定法。水华鱼腥藻的比较未见报道。笔者研究了可见分光光度法测定中只含有叶绿素a,测定其叶绿素a的含量可以作水华鱼腥藻的现存量,并与上述其它的3种常用的为该藻现存量的指标。测定方法采用Lorenzen[2]测定方法进行了系统比较。(1967)提出的单色分光光度法。考虑到提取效率、安全、保健等因素,本试验采用90%乙醇作为提1材料与方法取剂和溶剂。在50kPa压力下,用混合纤维素酯微1.1供试生物孔滤膜(孔径0.45μm)减压过滤藻液,然后将滤膜本试验所用的水华鱼腥藻(Anabaenaflos2aquae)剪碎放入玻璃研钵,加入7～8ml90%乙醇研磨提藻种是由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提取叶绿素a,再转入带塞离心试管中,使总体积略小供(编号FACHB-245)。于10ml,25℃下提取8h。将提取液在3000～4000[6]r/min下离心15min,移取上层清液,用90%乙醇定1.2培养方法通过试验,探索出一种适宜于水华鱼腥藻生长容到10.00ml。的培养基SE。在无菌条件下,取长势良好的藻种接叶绿素a的含量用岛津UV-120-02紫外、可种到内盛200ml培养基的锥形瓶中,藻液初始吸光见分光光度计测定。在1cm的石英比色皿中装入度A为0.02。在(27±1)℃下,用2支40W日光上述溶液,读取波长为665nm和750nm处的吸收稿日期:2001-11-233国家自然科学基金重点项目资助课题(No.49831005)胡先文,男,1972年生,硕士,讲师.工作单位:华中农业大学理学院,武汉430070 296华中农业大学学报第21卷光度。然后向比色皿中加入1滴1mol/LHCl酸化藻液F值(X)与叶绿素a含量(Y)间的线性关溶液,在1～15min内再次测定波长为665nm和系:33750nm处的吸光度,由此计算出藻液的叶绿素a含Y=-845.2+40.82Xr=0.9923[2]量。以上4个相关系数均大于r0.01=0.914,说明相3)荧光分光光度法。水华鱼腥藻中的叶绿素关性极显著,几种方法的测定结果有明显的可比性。a在可见光激发下可以发出荧光。试验中采用2.2几种测定方法的结果比较960MC荧光分光光度计直接测定藻液的荧光值F,将细胞计数法、荧光分光光度法和可见分光光测定条件为:波长λ=731nm;灵敏度SEN=2;纵度法的测定结果换算成叶绿素a含量,再对4种测轴比例YSCALE=2。定方法的结果进行对比(图1)。很明显,可见分光4)可见分光光度法。处于正常生长条件下的水光度法与叶绿素a含量测定法的测定结果最接近。华鱼腥藻摇匀时,藻液分布均匀、呈深绿色,采用722型分光光度计在最佳吸收波长处可以直接测定其吸光度A值。操作步骤为:将5号藻液摇匀,以培养液为参比,用1cm比色皿在不同波长处测定其A值,并作吸收曲线,得到最佳吸收波长(λ=680nm)。将各藻液摇匀,以培养液为参比,用1cm比色皿在最佳吸收波长处测定其A值。2结果与分析图14种测定方法的结果比较2.1几种测定方法之间的线性相关性分析Fig.1Comparisonontheresultoffourmeasuringmethods根据以上4种测定方法的结果(表1),分别以a.叶绿素a含量测定法Chlacontainingmeasurement;藻液吸光度、荧光值为自变量对细胞密度和叶绿素b.细胞计数法Cellcountingmeasurement;a含量进行线形回归分析。c.荧光分光光度法Fluorescencespectrophotography;d.可见分光光度法Visiblespectrophotography表1各藻液的测定值Table1Thedataofalgaesolutions2.3可见分光光度法与基本测定方法的比较序号细胞密度叶绿素a含量细胞计数法和叶绿素a含量测定法是藻现存量荧光值吸光度Serial(×105-3/ml)/mg·m测定的基本方法,是确定其它测定方法有效性的依FluorescenceAbsorbencenumberCelldensityContentofChla据。用这两种方法测得的藻液细胞密度和叶绿素a13.7195.320.40.054含量可以作为水华鱼腥藻现存量的指标。但叶绿素27.4334.933.20.102a含量测定法操作相当繁琐,耗费时间长,每提取、314.8842.744.20.199测定1次大约需要1d时间,且该方法破坏样品,不429.61730.162.10.391适于连续测定;细胞计数法操作虽然简单,但计数工559.23142.196.60.740作量很大,且重现性不好,人为因素影响大,误差较大。藻液A值(X)与细胞密度(Y)间的线性关系:通过几种测定方法间的线性相关性分析,可以56Y=-1.076×10+8.081×10X很清楚地看到:对于水华鱼腥藻,采用可见分光光度33r=0.9997法测定藻现存量,与前述2种基本测定方法有很好藻液A值(X)与叶绿素a含量(Y)间的线性关的一致性。采用这种测定方法所测得的藻液吸光度系:A值在一定条件下可以作为水华鱼腥藻现存量的指33Y=-45.53+4356Xr=0.9991标,在水华鱼腥藻的研究工作中具有非常重要的作藻液F值(X)与细胞密度(Y)间的线性关系:用,有较大的实用价值。64Y=-1.586×10+7.563×10X采用可见分光光度法测定水华鱼腥藻现存量,33r=0.9915操作简单、耗时短,测定1份样品只需1min;测定结 第3期胡先文等:可见分光光度法测定水华鱼腥藻297果重现性好,误差小;测定时不破坏样品,特别适于测定的有色物质。试验中藻密度一般较大,采用可连续监测,是一种非常简便、有效的测定方法。见分光光度法更方便、准确。2.4可见分光光度法与荧光分光光度法的比较这2种方法与基本测定方法(细胞计数法、叶绿参考文献素a含量测定法)的一致性都很好,其测得的F值和A值都可以作为水华鱼腥藻现存量的指标;2种1汤琳,袁峻峰,陈德辉.十二烷基苯磺酸钠对于几种藻类的毒性方法操作都很简单试验.上海师范大学学报,2000,29(2):70～73,适于连续测定。2AmericanPublicHealthAssociation,AmericanWaterWorksAssociation由于荧光分光光度计的灵敏度较高,而线性范&WaterPollutionControlFederation.Standardmethodsfortheexamina2围较小,当藻密度较小时,采用荧光分光光度法较tionofwaterandwastewater(16thEd.).Washington:WashingtonD.C.好;当藻密度较大时,采用可见分光光度法较好。本A.P.H.A.,1985.772～863试验中采用可见分光光度法与基本测定方法结果更3周永欣,章宗涉.水生生物毒性试验方法.北京:农业出版社,一致,这是因为试验中藻密度一般较大。当藻液中1989.170～1904章宗涉,黄祥飞.淡水浮游生物研究方法.北京:科学出版社,含有在最佳吸收波长有光吸收的物质时,一般采用1991.333～347荧光分光光度法,可以排除有色物质的干扰;当藻液5邓朝晖,袁峻峰,陈德辉等.三种除草剂对斜生栅藻生长的影响.中含有其它荧光物质的时,采用可见分光光度法为上海师范大学学报,2000,29(1):92～95宜。6楼士林,吴连群,何成新等.一种喜温蓝藻的培养方法.厦门大学学报,1996,35(6):955～9583讨论7李淑箐,陈子修,毛显得等.实验室叶绿素a浓度测定.海洋环境科学,1988,7(2):78～82采用可见分光光度法测定水华鱼腥藻现存量,8VollenweiderRA.Amanualonmethodsformeasuringprimaryproduc2方法简便、结果可靠,可以替代基本测定方法,有很tioninaquaticenvironments.Oxford:BlackwellScientificPublications,大的实际应用价值。这种测定方法的应用条件是:1969.213藻长势良好、藻液均匀;藻密度适当;藻液中无干扰TheMeasurementofAnabaenaflos2aquaewithVisibleSpectrophotography1)1)1)2)HuXianwenDongYuanyanZhangXinpingYeFabin1)(HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2)HuanggangNormalUniversity,Huanggang438000,China)AbstractThisarticlepresentsapracticalapproach,inwhichvisiblespectrophotographyisemployedtomeasuretheAofAnabaenaflos2aquaesolution.Theinsightfulcomparisonontheinterrelationsoftheabove2mentionedmethodandmethodsofcellcountingandChlacontainingmeasurementandfluorescencespectrophotography,andfoundthevisiblespectrophotographyisaconciseandreliableexperimentalapproach,revealingthesoundlinearinterrelationsbe2tweenthem,andtheAcanberegardedastheindexofthestandingcropofAnabaenaflos2aquae.KeywordsAnabaenaflos2aquae,measurement,visiblespectrophotography(责任编辑:陈红叶)'