分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基

'第28卷第2期成都大学学报(自然科学版)Vo.l28No.22009年6月JournalofChengduUniversity(NaturalScienceEdition)Jun.2009文章编号:1004-5422(2009)02-0091-04分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基颜军,苟小军,邹全付,纪小明,崔秀英,兰海蓉,李雪(成都大学中药化学实验室,四川成都610106)摘要:基于水杨酸可以捕获羟基自由基(#OH)生成2,3-二羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲酸,在波长510nm处有最大吸收的原理,建立一种用分光光度法检测Fenton反应产生的羟基自由基(#OH)的方法.通过对反应体系影响条件的优化,筛选出最佳反应物配比和最佳实验条件,并对其稳定性进行检测.在此基础上,测定抗氧化剂对羟基自由基(#OH)的清除率.结果表明:该体系反应灵敏、稳定性高,可作为抗氧化剂的筛选方法之一.关键词:Fenton反应;羟基自由基;分光光度法;水杨酸中图分类号:Q503文献标识码:A计,恒温水浴锅等.0引言本实验所用材料为:银耳多糖(本实验室自行提研究表明,自由基是引起人类衰老和许多疾病的重取),所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.要因素,例如癌症、多发性硬化症、帕金森疾病、免疫系1.2溶液的配制[1]统疾病等.羟基自由基(#OH)是人体内最主要的自FeSO4溶液(1.8mmol/mL):称取FeSO4晶体由基,其消除率是反映药物抗氧作用的重要指标.由于0.2736g,用水定容于100mL容量瓶中,使用时稀释-4羟基自由基(#OH)的反应活性大、寿命短(小于109倍.s)、存在浓度低,因此在有关羟基自由基(#OH)的研究H2O2(0.3%):取30%的过氧化氢溶液1.00[1,2]中,其分析测试方法就显得特别重要.mL,用水定容于100mL容量瓶中.目前,检测羟基自由基(#OH)的方法主要有,电子水杨酸-乙醇(1.8mmol/mL):称取水杨酸固体自旋共振法(ESR)、化学发光法、高效液相色谱法0.2486g,用无水乙醇定容于100mL容量瓶中,使用[3-7](HPLC)等,这些方法多数为间接测定方法,且仪器时稀释9倍.特殊,试剂昂贵,使其应用受到一定的限制.在几种常水杨酸-水溶液(1.8mmol/mL):称取水杨酸固用的羟基自由基(#OH)检测方法中,分光光度法较高体0.2486g,用水定容于100mL容量瓶中,使用时稀效液相色谱法和电子自旋共振法简便、直接,且由于其释9倍.所需设备简单,可供一般实验室检测使用,而被广泛采水杨酸-乙醇-水:水杨酸-乙醇与水的比例用.为1B3.本实验采用可见分光光度法,以水杨酸作为Fen21.3羟基自由基(#OH)的测定ton试剂反应产生的羟基自由基(#OH)的捕捉剂,使向试管中加入1100mL蒸馏水,FeSO4溶液2.00FeSO4、H2O2、水杨酸-乙醇成为一个反应体系,考查mL,水杨酸-乙醇1.50mL,最后加H2O2(0.03%)水杨酸捕获羟基自由基(#OH)的影响因素,并将确定0.10mL启动反应,振荡混合,在波长510nm处测定的Fenton的反应体系用于抗氧化剂的筛选.其吸光度值.1.4自由基清除剂清除羟基自由基(#OH)作用1材料与方法向试管中加入一系列不同浓度多糖溶液1.001.1材料与仪器mL,FeSO4溶液2.00mL,水杨酸-乙醇1.50mL,最本实验所用仪器包括:紫外可见扫描分光光度后加H2O2(0.03%)0.10mL启动反应,振荡混合,水收稿日期:2009-05-12.基金项目:四川省中医药管理局科技专项基金资助项目(2008-01).作者简介:颜军(1971)),男,高级实验师,从事生物活性成分的提取及检测研究1 #92#成都大学学报(自然科学版)第28卷浴37e,保温30min,在波长510nm下测量各自的吸光度值.自由基清除率计算公式为:D=[(A0-AS)/A0]@100%式中,A0为空白管的吸光度,AS为加入自由基清除剂后的吸光度2结果与讨论2.1吸收光谱图3FeSO4溶液用量对体系吸光度的影响分别测定水杨酸-水溶液、水杨酸-乙醇-水吸光度变化不大甚至开始降低.故本实验所采用的溶液、水杨酸-乙醇溶液在波长200~700nm范围内FeSO4溶液用量确定为2.00mL.的吸收光谱(见图1).测量结果表明水杨酸在上述32.3水杨酸-乙醇用量的影响种溶液中的特征吸收没有发生变化.测定如1.3所述根据2.2实验的结果,确定FeSO4溶液用量为2反应体系的吸收光谱(见图2),发现此反应体系在mL,改变水杨酸-乙醇的体积,其他反应条件不变,490~550nm波长处有吸收.这说明水杨酸作为捕捉考查水杨酸-乙醇的用量对体系吸光度的影响,结剂可成功捕捉Fenton试剂产生的羟基自由基(#果如图4所示.OH),产物在490~550nm波长范围内有特征吸收,最大吸收波长为510nm.图4水杨酸-乙醇用量对体系吸光度的影响实验结果表明,随着水杨酸-乙醇体积的增大,吸光度A也增大,当水杨酸-乙醇的体积达到1.25图1水杨酸溶液紫外扫描图mL后,吸光度A变化不大.为了实验方便,选用水杨酸-乙醇的体积为1.50mL.2.4H2O2浓度对体系吸光度的影响根据所得的最佳配比,配置不同浓度的H2O2,取0.10mL,继续考查H2O2的浓度对体系的影响,结果如图5所示.图21.3反应体系紫外扫描图2.2FeSO4用量的影响在1.3所述反应体系的基础上,改变FeSO4溶液的体积,考查FeSO4溶液不同的用量对体系吸光度的影响,结果如图3所示.实验结果表明,随着FeSO4溶液体积的增大,体系的吸光度也随之增大,当体积增大到2.00mL时,图5H2O2的浓度对体系吸光度的影响 第2期颜军,等:分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基#93#实验结果表明,H2O2的浓度为0.3%、0.15%、(#OH)的清除能力均与抗氧化剂用量成量效关系,0.03%时,吸光度A变化不大,而当浓度低于即当抗氧化剂用量增大时,羟基自由基(#OH)清除0.015%时吸光度A开始下降.为了实验的准确性,率也增加.结果表明,本体系的建立对筛选清除羟基选用H2O2的浓度为0.03%.自由基(#OH)的天然抗氧化剂,以及研究清除自由2.5反应温度对体系的影响基的机理有一定的应用价值.根据上述实验结果所确定的反应物物质的量的3结论配比,即:FeSO4溶液2.00mL,水杨酸-乙醇1.50mL,H2O2(0.03%)0.10mL,蒸馏水1.00mL.表1为通过本实验考察所确定的体系为:1.8mmol/mL反应体系在不同的温度下测试反应温度对体系吸光的FeSO4溶液2.00mL、1.8mmol/mL水杨酸-乙醇度的影响数据.溶液1.50mL、0.03%H2O20.10mL,蒸馏水(或抗氧表1反应温度对体系的影响化剂)1.00mL,在37e的反应温度下,反应30min,然后进行吸光度的测定.编号12345反应温度/e2732374247本实验证明,水杨酸作为羟基自由基(#OH)的A5100.6450.6390.6370.5520.446捕捉剂,采用分光光度法可较准确地测定羟基自由基(#OH)的产生.同时,对影响Fenton反应的因素表1的数据表明,体系在27e、32e和37e情进行了考察,为Fenton反应在实际中的应用提供了况下,温度对吸光度影响不大,由于37e具有特殊参数依据.实验表明,该法简便实用,是筛选自由基意义,因此反应体系的温度确定为37e.清除剂的一种有效方法.2.6稳定性实验根据实验所确定的反应物物质的量的配比,即:FeSO4溶液2.00mL,水杨酸-乙醇1.50mL,H2O2参考文献:(0.03%)0.10mL,蒸馏水1.00mL,考查在37e下[1]韩鹤友,何治柯,曾云鹗.羟自由基的分析研究进展[J].体系的稳定性,结果见表2.分析科学学报,2001,17(1):84-86.表2稳定性实验结果[2]王仕良,张曾,黄干强.羟基自由基的产生与测定[J].反应时间/min102030405060PaperScienceandTechnology,2003,22(6):45-47.A5100.6450.6480.6490.6480.6490.649[3]StokesNJ,TabnerBJ,HewittCN.Determinationofhydroxylradicalconcentrationinenvironmentalchambersusingelectron表2的数据表明,确定的体系在60min内吸光spinresonance[J].Chemosphere,1994,28(5):999-1008.度值基本不变,可见本方法的稳定性好.[4]SteinerMG,BabbsCF.Quantitationofthehydroxylradical2.7清除剂对羟基自由基(#OH)的清除作用byreactionwithdimethylsulfoxide[J].ArchBiochemBio2依照实验方法,采用Vc、银耳多糖对羟自由基phys,1990,278(2):478-481.(#OH)的清除能力进行了分析,实验结果见图6.[5]徐向荣,王文华,李华斌.比色法测定Fenton反应产生的羟自由基及其应用[J].生物化学与生物物理进展,1999,26(1):67-69.[6]朱琳娜,何争光,吴超.NR光度法测定Fenton试剂所生成的羟基自由基[J].福建分析测试,2006,15(3):10-12.[7]方光荣,刘洁,刘丽虹.分光光度法测定中药对羟自由基的清除率[J].湖北大学学报(自然科学版),2004,26(2):151-1541(下转第103页)图6抗氧化剂对羟基自由基(#OH)的清除率由实验结果可知,各抗氧化剂对羟基自由基 第2期胡一冰,等:苦荞芽提取物的镇痛抗炎作用#103#AnalgesicandAnti2inflammatoryEffectsofExtractsfromTartaryBuckwheatSproutsHUYibing,ZHAOGang,PENGLianxin,YANGJingdong,ZOULiang(SchoolofBioindustry,ChengduUniversity,Chengdu610106,China)Abstract:Toobserveanalgesicandanti2inflammatoryeffectsofextractsfromtartarybuckwheatsprouts,mousehot2platetestwastakentoobserveanalgesiceffectsofextractsfromtartarybuckwheatsproutsandmodelsofinflammatoryreactionsofdimethylbenzene2inducedmouseearedemawereper2formedtoobserveitsinflammatoryreactionsonmice.Theresearchresultsshowthatthelatencyoflickingofthehindpawsisprolongedbytheextracts.Itcanreducetheextentofearswellinginducedbydimethylbenzeneinmice(P<0.01,P<0.05).Thefindingsshowthatextractsfromtartarybuck2wheatsproutshaveeffectsonanalgesiaandanti2inflammation.Keywords:extractsfromtartarybuckwheatsprouts;analgesia;anti2inflammation(上接第93页)DeterminationofHydroxylRadicalGeneratingfromFentonReactionbySpectrophotometryYANJun,GOUXiaojun,ZOUQuanfu,JIXiaoming,CUIXiuying,LANHairong,LIXue(ChemistryLaboratoryofTraditionalChineseMedicine,ChengduUniversity,Chengdu610106,China)Abstract:Toproduce2,3-dihydroxybenzoicand2,5-dihydroxybenzoic,salicylicacidwasusedtocatchhydroxylradical(#OH)byspectrophotometerdetermininghydroxylradicalproducedbyFen2tonreaction.Thereactantshaveanabsorptionmaximumat510nm.Reactionsystemwasoptimizedtoscreenoutthebestreactantmatchandoptimalexperimentalconditionsanditsstabilitywastested.Basedontheabove,clearancerateofantioxidantonhydroxylradicalwasmeasured.Thefindingsshowthatthissystemhassensitivereaction,highstabilityandcanbeusedtofilterantioxidan.tKeywords:Fentonreaction;hydroxylradica;lspectrophotometry;salicylicacid(上接第97页)IsolationandMolecularCharacterizationofTwoFungiofCathayaArgyrophyllaRhizosphere122ZHAOYingru,GOUXiaojun,YANJun(1.CollegeofBiologicalSciencesandBiotechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China;2.ChemistryLaboratoryofTraditionalChineseMedicine,ChengduUniversity,Chengdu610106,China)Abstract:TwofungalstrainsF-1andF-2whichisolatedfromtherhizosphereofCathayaargyro2phyllaweredifficulttodistinguishbasedontheirmorphologicalcharacteristics.Thus,molecularmeth2odwasusedtoidentifythetwofungalstrains.TherDNAITSregionsofthetwofungiwereamplifiedandsequenced.ITSsequencesanalysisofthetwofungiandother30fungalstrainsfrom10differentgenusshowedthatF-1strainbelongstotheTrichodermaspp.andF-2strainbelongstotheMor2tierellaspp..Thisstudyrevealsthatthemolecularmethodwhichisfas,taccurate,simpleandhighef2ficientplaysanimportantroleinresearchofFunguscharacterizationandclassification.Keywords:Fung;iITS;phylogeny;molecularcharacterization'