分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量

'第29卷第2期浙江工业大学学报Vol.29No.22001年6月JOURNALOFZHEJIANGUNIVERSITYOFTECHNOLOGYJune2001文章编号:1006-4303(2001)02-0120-04分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量许培雅,郑裕国,沈寅初(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310032)摘要:建立了测定红发夫酵母胞内虾青素含量的前处理工艺及分光光度分析方法。其前处理工艺一次提取率达96.2%,提取液在480nm处有最大吸收,建立的分光光度法加标回收率为100.2%~104.1%,标准偏差为0.21%~0.43%,表明该分析方法准确性高,重复性好,且简便、快速,可以作为菌种筛选、发酵条件优化过程中快速测定菌体中虾青素含量的方法。关键词:分光光度法;红发夫酵母;虾青素中图分类号:Q815;O657.3文献标识码:AAnalysisofastaxathinfromphaffiarhodozymabyspectrophotometryXUPe-iya,ZHENGYu-guo,SHENYin-chu(CollegeofBiological&EnvironmentalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032,China)Abstract:Atechniqueoftreatmentbeforeassayandananalyticalassayofastaxathinweredesignedfromphaffiarhodozymabyspectrophotometry.Thepercentageofextractionreached96.2%inthetechniqueoftreatmentbeforeassay.Themaximumabsorptionofthesolutionlayis480nm.Therecov-eryis100.2%~104.1%;andthestandarddeviationis0.21%~0.43%.Themethedissimpleandapplicabletoanalysisofastaxathinfromphaffiarhodozymainthefiltrationofmutantstrainandtheoptimizationoffermentationcondition.Keywords:spectrophotometry;phaffiarhodozyma;astaxathin0前言虾青素(3,3c-二羟基-4,4c-二酮基-B,Bc-胡萝卜素)属于一种类胡萝卜素,是甲壳类动物,如虾、蟹、三文鱼和鲑鳟鱼的主要色素。它具有很强的抗氧化功能,能清除体内由紫外线照射产[1]生的自由基,调节降低这些由光化学引起的伤害,对紫外线引起的皮肤癌有很好的治疗效果。它能治疗由糖尿病引起的白内瘴以及由用电脑和看电视过多引起的眼病,虾青素已经越来越多地受到各国科学家的重视。虾青素的天然来源主要有:甲壳类动物,雨生红球藻和红发夫酵母。目前,收稿日期:2000-10-17;修订日期:2001-02-18基金项目:浙江省院士基金项目(2000268)作者简介:许培雅(1964-),女,浙江鄞县人,实验师,主要从事生化物质的分离纯化和检测方面的研究。 第2期许培雅,等:分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量#121#用红发夫酵母生产虾青素的研究已在全球兴起。虾青素的定量分析是从事虾青素研究、生产及应用所不可缺少的基本方法,然而,虾青素是胞内物质,酵母细胞的细胞壁不容易破碎,这给酵母中虾青素含量测定带来了困难。酵母细胞的破壁方法一般有:物理法(机械碾磨、超声波)、化学渗透法、酶法(包括自溶法)和酸热法几种。物理法需要增加昂贵的设备,且效果并不十分理想;酶法虽然条件温和,但破壁时间长,不适合定量分析;酸热法条件难以控制,且虾青素在酸性条件下不稳定;有机溶剂渗透法适合于需要测定的样品量多的情况。经过多次实验以及各种有机溶剂提取效果的比较,我们得到了用有机溶剂进行破壁提取,然后用分光光度法或高效液相色谱法来测定其含量的一种分析方法。高效液相色谱法灵敏度高,试样用量少,但设备昂贵,大批量测定耗时长。分光光度法,其灵敏度高,且操作简便、快速、经济,特别适合大批量测定。1实验部分1.1仪器与试剂高效液相色谱仪(日本岛津公司),721型分光光度计或751型分光光度计(上海分析仪器厂),恒温水浴锅,高速冷冻离心机(日本日立公司);虾青素标样(Sigma公司),丙酮(A.R),二甲基亚砜(A.R),甲醇(A.R),冰醋酸(A.R),混合破壁试剂:由冰醋酸和二甲基亚砜按一定比例配制而成,混合提取试剂:由甲醇和氯仿按一定比例配制而成。1.2实验方法1.2.1提取工艺发酵液经12000r/min离心10min后,用蒸馏水洗二遍,离心得鲜酵母,加入混合破壁试剂,搅散后加入混合提取试剂,搅匀,等菌体变白后,离心,得提取液。1.2.2样品测定按照最佳提取工艺,得到提取液,在最大吸收波长下,以试剂空白调零,测其吸光度。提取率的测定用高效液相色谱法。2结果与讨论2.1虾青素分析的前处理试验2.1.1不同溶剂对酵母破壁效果的影响[2]红发夫酵母化学法破壁提取已有一些报道,Meyer等提出以甲醇进行破壁提取,Sedmark等提[3]出以冰醋酸破壁,用有机溶剂进行提取,PilarCalo等提出以二甲基亚砜破壁,用己烷提取的方[4]法,我们综合上述方法,结合酵母的实际,得到了用二甲基亚砜和冰醋酸按一定比例配制而成的混合破壁试剂溶解细胞膜上的脂质化合物,使细胞结构破坏,用氯仿和甲醇按一定比例配制而成的混合提取试剂提取虾青素。图1是不同溶剂对酵母细胞中的虾青素提取率的影响。由图1可发现,我们得到的用混合试剂进行破壁提取的效果最好,这是由于混合破壁试剂更有利于破坏细胞壁的结构,混合提取试剂更容易使虾青素溶出。2.1.2混合破壁试剂的加量对虾青素提取率的影响图1不同破壁溶剂对虾青素按照实验方法,混合破壁试剂加量为菌体量的20倍,测提取率的影响得虾青素提取率与混合破壁试剂加量的关系如图2。 #122#浙江工业大学学报第29卷图2破壁试剂加量对虾青素图3破壁试剂的温度对虾青素提取率的影响提取率的影响由图2可知,随着混合破壁试剂加量的增加,虾青素的溶出量逐渐提高,当混合破壁试剂:混合提取试剂=1:1时,虾青素的溶出量达到最大,加量视菌体中虾青素的含量高低而定。2.1.3混合破壁试剂温度对虾青素提取率的影响按照实验方法,混合破壁试剂:混合提取试剂=1B1,加量均为菌体量的20倍,测得破壁试剂温度对虾青素提取率的影响如图3。由图3可知,随着温度的提高,虾青素提取率提高,当温度超过50e以后,提取率保持不变,这是由于温度升高,有利于有机溶剂破坏酵母细胞壁和细胞膜的结构,有利于酵母细胞内的虾青素溶出,但温度过高,易破坏已溶出的虾青素,因此选择破壁试剂的温度为50e。2.1.4混合破壁试剂的处理时间对虾青素提取率的影响按照实验方法,混合破壁试剂:混合提取试剂=1B1,加量均为菌体的20倍,加入混合破壁试剂搅匀后放置不同时间加混合提取试剂,测得虾青素提取率与处理时间的关系如图4。由图4可知,破壁试剂处理时间对提取率有一定影响,因为游离的虾青素不稳定,遇光和热都容易破坏,但在15min之内没有什么影响,即菌体均匀分散后就可加入提取试剂。同样道理,提取试剂加入后也应尽快加以测定。2.1.5虾青素分析前处理工艺流程由上述单因素试验确定最佳前处理工艺路线为:发酵液经离心后,水洗二次,离心得菌体,加入50e的混合破壁试剂,搅匀后加入与破壁试剂等量的混合提取试剂,搅匀,等菌体变白后,离心,上清液用分光光度法或高效液相色谱法分析。2.1.6虾青素提取率的测定根据虾青素前处理工艺进行多次提取,用高效液相色谱分析测得每次提取率如下:提取次数123提取率/%96.23.10.7由此可见,只要加入提取试剂后尽可能使菌体分散,菌体颜色变白,虾青素的一次提取率可达96.2%以上。此提取工艺可以作为分析酵母中虾青素含量的前处理方法。图4破壁试剂处理时间对青素1-标样;2-酵母提取液提取率的影响图5吸收曲线 第2期许培雅,等:分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量#123#2.2分光光度法测定提取液中虾青素的含量2.2.1吸收曲线对标准样品和酵母提取液,以混合破壁试剂:混合提取试剂=1B1为空白调零,测定不同波长下的吸光度,其吸收曲线如图5。从图5可以看出,酵母提取液和虾青素标样一样,其最大吸收波长是480nm,且其峰型非常相似,370nm波长以下,酵母提取液的吸收峰明显高于虾青素标样,这是由于酵母中其它杂质如蛋白质、脂肪等被溶出,杂质在370nm以下波长下吸收值比较大的缘故。2.2.2标准曲线线性相关性称取一定量的虾青素标样,用少量氯仿溶解后,用混合破壁试剂:混合提取试剂=1B1为溶剂稀释成不同浓度,以试剂空白作为对照,在480nm波长下测定吸光度,平行测定6次,测定结果见表1,表明虾青素浓度在0~4Lg/ml范围内,线性关系较好。2.2.3精确度精确度用标准偏差和相对偏差表示,结果见表1,表明标准偏差S在0.21%~0.43%之间,相对偏差C在0.27%~2.72%之间。表1回归分析及精确度浓度吸光度S/%C/%/(Lg#ml)0.500.0980.0930.0920.0990.0940.0970.262.721.000.2050.2070.2020.2040.1970.2060.331.622.000.3930.3920.3900.3950.3900.3880.230.583.000.6000.5880.6000.5980.5930.5950.430.724.000.7820.7780.7820.7820.7850.7800.210.27相关系数0.99980.99960.99960.99990.99980.99972.2.4回收率实验在酵母提取液中加入虾青素的各个标准量,测得回收率为100.2%~104.1%,结果见表2。表2回收率测定结果-1-1-11)试样测定值/(Lg#ml)加标量/(Lg#ml)加标测定值/(Lg#ml)回收率/%0.3611.001.375101.40.7181.001.759104.11.4561.002.486103.00.2712.002.279100.40.5392.002.579102.01.0932.003.099100.30.1803.003.187100.20.3593.003.409101.70.7293.003.784101.8注:1)回收率=(加标测定值-试样测定值)/加标量@100%(下转第135页) 第2期联昌全,等:笼形水合物分离技术#135#参考文献:[1]胡春,裘俊红.天然气水合物的结构性质及应用[J].天然气化工,2000,25(4):48.[2]樊栓狮,程宏远,陈光进,等.水合物法分离技术研究[J].现代化工,1999,19(2):11.[3]樊栓狮,郭天民.笼型水合物研究进展[J].化工进展,1999,1:5.[4]HuangCP,FennemaO,PowrieWD.GashydratesinaqueousorganicsystemsÑ.preliminarystudies[J].Cryobiology,1965,1:109.[5]WillsonRC,BulotE,CooneyCL.Clathratehydrateformationenhancesnear-criticalandsupercriticalextractionequilibria[J].ChemEngCommun,1990,95:47.[6]WillsonRC,BulotE,CooneyCL.Useofhydratesforaqueoussolutiontreatment[P].US4678583,1987.[7]YoonJiHo,LeeH.Clathratephaseequilibriaforthewater-pheno-lcarbondioxidesystem[J].AIChEJ,1997,43(7):1884.[8]SugierA,BourgmayerP,RojeyA,etal.Processforextractionofwatermixedwithaliquidfluid[P].US5055178,1991.[9]ElliottRB,BarracloughBL,VaoderborghNE.etal.Apparatusforrecoveringgaseoushydrocarbonsfromhydrocarbon-containingsolidhy-drates[P].US4424858,1984.[10]HappelJ,HnatowMA,MeyerH.Thestudyofseparationnitrogenfrommethanebyhydrateformationusinganovelapparatus[J].AnnalsoftheNewyorkAcademyofsciences,1994,715:412.[11]DouglasG,ElliotHouston.Processforseparatingselectedcomponentsfrommulti-componentnaturalgasstreams[P].US5660603,1997.[12]PeterEnglezos.Clathratehydrates[J].IndEngChemRes,1993,32:1251.(责任编辑:翁爱湘)(上接第123页)3结论用混合破壁试剂和混合提取试剂来提取酵母细胞中的虾青素,一次提取率高。用分光光度法测定快速、简便、线性关系好,灵敏度高,标准偏差在0.21%~0.43%之间,相对标准偏差在0.27%~2.72%之间,可以作为菌种筛选,发酵条件优化过程中快速测定菌体中的虾青素含量的方法。参考文献:[1]王业勤,李勤生.天然类胡萝卜素[M].北京:中国医药科技出版社,1997.[2]MeyerPS,DuPreez,KillianSG.Selectionandevalutionofastaxanthinoverproducingmutantsofphaffiarhodozyma[J].WorldJMirobioBiotechnol,1993,9:514-520.[3]SedmarkJJ,WeeradingheDK,JollySO.Extractionandquantitationofastaxanthinfromphaffiarhodozyma[J].Biotechnoltech,1990,4(2):107-112.[4]PilarCalo,JorgeBVelazquez,CarmenSieiro,etal.analysisofastaxantionandothercarotenoidsfromseveralphaffiarhodozymamutants[J].JAgricFoodChem,1995,43:1396-1399.(责任编辑:陈石平)'